Одержання, характеристика та використання ферментів отрути Щитомордника звичайного (Agkistrodon halys halys)

Активність по ВАЕЕ і ВАМЕ відсутня. Питома активність досліджуваного ферменту складала 15, 6 мкмоля фібриногену/хв/мг. рН оптимум дії фібриногенолітичного ферменту складав 7, 5-8, 0.

Фібринолітичну активність очищеного ферменту визначали, використовуючи фібринову платівку. Активність ферменту розраховували, визначаючи кількість розщепленого фібрину 1-им мг ферменту за 1 хв на даній площині. Інкубація отриманого ферменту з фібрином показала наявність незначної фібринолітичної активності: 1 мг ферменту за 1 хв розщеплював 17, 3. 10-3 мкмоля фібрину.

Км фібриногенолітичного ферменту визначали, використовуючи фібриноген як субстрат у діапазоні концентрацій од 0, 25 – 4 мг/мл. Потім додавали 2 NIH/мл тромбіну (значний надлишок відносно фібриногену, що приводить до швидкого утворення фібринового згустку). Фібринові згустки, що утворилися, видаляли одночасним викручуванням і віджиманням скляною паличкою. Абсорбцію частково деградованого фібриногену, що залишився в розчині, визначали спектрофотометрично при довжині хвилі 280 – 320 нм. Для розрахунку Км використовували графік, побудований у координатах Лайнуівера-Берка. Отримане значення Км ферменту складало 5, 6 мкМ.

Проведені нами дослідження впливу ферменту на індуковану АДФ агрегацію тромбоцитів показали, що в його присутності швидкість агрегації, у порівнянні з контролем, знизилася до 77. 3%, максимум агрегації знижувався до 47%. Дезагрегація тромбоцитів, характерна для контролю, в присутності ферменту не спостерігалася (рис. 4). Порушення агрегації тромбоцитів у присутності ферменту, імовірно, пов'язане з розщепленням фібриногену, що відіграє важливу роль у процесі агрегації. Раніше було показано (Позднякова, Горкун, 1993), що фібриноген у ході його розщеплення плазміном втрачає здатність бути кофактором індукованої АДФ агрегації тромбоцитів у суспензії відмитих кров'яних пластинок. Фрагменти Х, що утворилися в процесі розщеплення фібриногену плазміном, менш активні, ніж фібриноген, а фрагменти У і Д зовсім неактивні. Це свідчить про те, що деградація С-кінцевої ділянки А-ланцюга (С-домена) послаблює кофакторну активність фібриногену.

Дослідження дії на фермент інгібіторів протеїназ – етилендіамінтетраацетат (ЕДТА), бензамідина, дітіотриетола, іодацетаміда, диізопропілфторфосфат (ДФФ), парахлормеркурбензоат (ПХМБ) – показало, що з вищевказаних інгібіторів тільки ДФФ і бензамідин у концентрації 20 мМ протягом 10 хв цілком пригнічували протеолітичну активність ферменту. При дії дитіотриетола (20-50 мМ) залишалося 70% активності. Очевидно, руйнування дисульфідних зв'язків не приводить до повної інактивації ферменту.

Інгібування активності ферменту ДФФ і бензамідином, які є інгібіторами серинових протеїназ, дозволяє віднести його до серинових протеїназ трипсинового ряду.

Фібриногенолітичний фермент термолабільний. Інкубація при 37оС протягом 2-х годин приводила до втрати 60% активності, однак молекулярна маса ферменту при цьому не змінювалася. При інкубації при 22оС фермент залишався активним протягом 5 год; при 4оС активність ферменту в розчині зберігалася до 48 год. Фермент нестабільний у розчині без стабілізатора, однак у 0, 02% розчині БСА (бичачий сироватковий альбумін) у замороженому стані він зберігається без втрати активності протягом року.

 

Таблиця 1. Деякі фізико-хімічні характеристики фібриногенолітичного ферменту отрути щитомордника звичайного (Agkistrodon halys halys) 

 

Специфічність Фібриногенази, виділені з отрути змій зазначених видів, розщеплюють А -ланцюг

фібриногену

Питома активність, мг/хв/мг фібриногену 35, 3 33 20 36, 6 15, 6

 

Н. в. – не визначали; 1- Quang C., Huang T., 1976; 2- Quang C., 1983; 3 – Retzious A., Marcland F., 1990; 4 – Marcland F., 1988.

Таким чином, виділений з отрути Agkistrodon halys halys фермент відноситься до групи фібриногеназ, за виявленими властивостями подібний до фібриногенолітичних ферментів, виділених з отрути інших видів змій роду Agkistrodon (таб. 1).

Отриманий фермент може бути використаний при вивченні структурних і функціональних взаємодій систем зсідання крові і фібринолізу.

 

Виділення та очищення активатора протеїну С

За даними літератури (Kisiel, 1987, 1988; Klein, Walker, 1986; Choi, 1987; Esmon, 1988 та ін.) виділення препаратів активатора протеїну С включає 3-4 етапи із застосуванням методів іонообмінної, афінної хроматографії, гель-фільтрації, хроматографії високого тиску. Як адсорбенти використовують QAE-сефадекс А-50, апротинін-сефарозу, сефадекси G-75, G-100, Mono Q. Такий спосіб виділення й очищення є тривалим, вимагає дорогих матеріалів, на кожному наступному етапі втрачається значна частина активного матеріалу. У зв'язку з вищенаведеним, перед нами стояла задача розробити такий максимально простий і ефективний спосіб виділення й очищення білкового препарату, що дозволив би на основі отриманого ферменту створити препарат, придатний для використання в практичній медицині. Виділення й очищення активатора протеїну С проводили, використовуючи методи іонообмінної хроматографії і гель-фільтрації. Після видалення з цільної отрути тромбіноподібного фермента матеріал, що не зв'язався з носієм, піддавали подальшому розділенню за методом іонообмінної хроматографії на Q-сефарозі. Вісім отриманих фракцій були перевірені тестом „тромбіновий час” для виявлення фібриногенолітичного ферменту та тестом АЧТЧ, що використовується для визначення в плазмі крові рівня протеїну С. Згідно з тестом АЧТЧ в матеріалі фракції №1 було виявлено компонент, що подовжував час зсідання подібно активатору протеїну С – препарату „Protac” (Pentapharm AG, Німеччина), – виділеного з отрути A. contortrix contortrix. (див. рис. 2А). Електрофоретичний аналіз фракції №1 показав наявність білкових домішок. Видалити їх рехроматографією не вдалося, тому для подальшого очищення білка проводили гель-фільтрацію на суперозі 12 HR 10/30. Зразок (0, 3% від об’єму колонки) у 0, 05 М трис-НС1 буфері рН 8, 2 наносили і елюювали зі швидкістю 0, 4 мл/хв тим