Одержання, характеристика та використання ферментів отрути Щитомордника звичайного (Agkistrodon halys halys)

Предмет:

Тип роботи:

Автореферат

К-сть сторінок:

Мова:

Українська

Оцінка:

веронал-HCl буфері рН 7. 5, що містить 0, 13 М NaCl і 1. 10-3 М NaN3, і після видалення центрифугуванням часток, що не розчинилися, наносили на колонку з цибакрон-сефарозою, врівноважену тим же буфером. Тромбіноподібний фермент, що зв'язався, елюювали лінійним градієнтом концентрації NaCl від 0 до 2 М у 0, 02 М веронал-HCl буфері, рН 7. 5, об’єм градієнту 50 мл, швидкість елюції 0, 5 мл/хв. Із сорбентом зв'язувалося близько 10-12% від нанесеної кількості білків отрути (Соловйов, Угарова, 1993). У білковому матеріалі, що не зв'язався з колонкою (88-90% від вихідного), коагулюючої активності практично не було. Аналіз цього матеріалу методом зимографії показав наявність фібриногенолітичної активності. Подібна активність раніше була виявлена в отруті інших змій. З даних літератури відомо, що на одному з етапів одержання фібриногеназ використовується аніонообмінник. Виділення білкової фракції, що має фібриногенолітичну активність, ми проводили на Q-сефарозі, врівноваженій 0, 05 М трис-HCl буфером рН 8, 2. Вибір цього носія був обумовлений його високою ємністю, стійкістю гелю при зміні умов: через наявність поперечних зшивок гель сефарози має значну твердість (на відміну від іонообмінників на основі декстрана). Щоб уникнути змін величини рН і іонної сили, через що сорбція може бути низькою, для зниження концентрації білкової суміші досліджуваний матеріал розбавляли в 7-10 разів і наносили на колонку із швидкістю 0, 35 мл/хв. Білки, що сорбувалися на Q-сефарозі, елюювали лінійним градієнтом 0 – 0, 2 М NaCl. Проведена робота дозволила визначити величину іонної сили, при якій елююється фракція білка, що має фібриногенолітичну активність.

Однак використання лінійного градієнту концентрації NaCl не привело до якісного розділення компонентів (рис. 1), тому наступним кроком було використання ступінчатого градієнта концентрації 0 – 0, 2 М NaCl у тому самому буфері зі швидкістю 0, 8-1 мл/хв. Було зібрано вісім білкових фракцій (рис. 2А). Матеріал фракції 5 виявляв фібриногенолітичну активність, про що свідчило істотне уповільнення часу згортання тромбіном фібриногену (2 мг/мл) або цільної плазми крові в тесті “тромбіновий час”.

Електрофоретичний аналіз матеріалу фракції 5 показав наявність високо- і низькомолекулярних домішок інших компонентів отрути. Рехроматографія виділеної фракції, а також гель-фільтрація на суперозі 12В не поліпшили гомогенність препарату. В зв’язку з цим наступним етапом очищення було використання методу гідрофобної хроматографії. Очищення препарату проводили на колонці з алкіл-сефарозою (HR 5/5). Зв'язування білкового матеріалу фракції здійснювали в 0, 1 М фосфатному буфері, рН 7. 0, що містить 2, 0 М (NH4) 2SO4. При такій високій концентрації солі немає необхідності в зміні буферу при нанесенні зразку і, крім того, білок елююється з хорошим виходом. Після нанесення матеріалу на колонку білки, що не зв'язалися, видаляли тим же буфером. Елюцію матеріалу, що зв'язався, проводили зворотним лінійним градієнтом у 0, 1 М фосфатному буфері, рН 7. 0, знижуючи концентрацію (NH4) 2SO4 з 2, 0 М до 0, 1 М. В результаті розділення було отримано сім білкових фракцій. За допомогою тесту “тромбіновий час” матеріал з фібриногенолітичною активністю було виявлено у фракції 7 (рис. 2Б). Молекулярна маса ферменту, за даними DS-Na електрофореза в ПААГ, складає 28 кДа. Виділений фермент є глікопротеїном: фарбування реактивом Шиффа показало наявність вуглеводного компонента. Специфічність дії очищеного ферменту на фібриноген ми досліджували, аналізуючи продукти руйнування фібриногену після інкубації фібриногену (2 мг/мл) з ферментом у 0, 05 М трис-НС1 буфері рН 7. 4, що містить 0, 13 М NaCl, при кімнатній температурі. Вагове співвідношення ферменту до фібриногену складає 1: 250. Аліквоти відбирали через 2, 5, 10, 15, 20 хв, 24 години, реакцію зупиняли додаванням DS-Na до 0, 2%. Електрофоретичний аналіз у 10% ПААГ у присутності DS-Na показав, що під дією ферменту в початковий період реакції руйнується A-ланцюг фібриногену. При більш тривалій інкубації фермент незначно руйнує В-ланцюг, але -ланцюг залишається інтактним. Також було показано, що при дії фібриногенолітичного ферменту на фібриноген кінцевим продуктом розщеплення є фрагмент, по молекулярній масі відповідний пізньому Х-фрагменту фібриногену. Здатність згортання цього фрагмента порушена так само, як і в аналогічному по молекулярній масі продукті плазмінового гідролізу фібриногену. Перевірка дії ферменту на ДД-, Д- і Е-фрагменти фібриногену показала відсутність подальшого розщеплення.

Для з’ясування дії фібриногенолітичного ферменту на фібриноген у плазмі крові було створено модельну систему (рис. 3). Одержані результати показують, що швидкість розщеплення фібриногену в модельній системі вища, ніж у плазмі крові. Ми вважаємо, що це пов'язано з дією присутніх у плазмі крові інгібіторів серинових протеїназ, до яких відноситься фібриногенолітичний фермент. В обох випадках уповільнення часу згортання фібриногену під дією тромбіну пов'язано зі зменшенням у суміші під дією ферменту концентрації фібриногену. Отримані нами результати добре узгоджуються з даними літератури. Для визначення амідолітичної активності ферменту використовували хромогенні субстрати для плазміну, тромбіну і фактора Х. Швидкість розщеплення субстрату (вивільнення p-NA) визначали при довжині хвилі 405 нм. В результаті показано, що фермент розщеплював субстрат плазміну S2251 (0, 175 мкМ pNA/хв/мг), субстрат тромбіну S2238 (0, 325 мкМ pNA/хв/мг) і не діяв на субстрат фактора Ха (S2222). Одержані нами дані дозволяють припустити, що фермент руйнує пептидні зв'язки, утворені карбоксильними групами лізину та аргініну, тобто за специфічністю подібний до плазміну. Фермент виявляв естеразну активність, визначену по ТАМЕ: 23 мкмоля/хв/мг, і