Загальна теорія поглинання світла молекулами

Предмет:

Тип роботи:

Реферат

К-сть сторінок:

Мова:

Українська

Оцінка:

розподіли. Один з променів проходить через кювету з розчинником, інший - через кювету з досліджуваним речовиною. На відношення випромінювань, що виходять з обох кювет, величина джерела світла не робить ніякого впливу. Ставлення випромінювань може бути виміряна двома способами.Промені, що вийшли з кювет, спрямовуються на катоди двох фотоемісійних ламп або фотопомножувач. Виходи цих детекторів пов'язані серією опорів, посилюють різницю між двома фотоструму і реєструють величину поглинання. Зручністю двопроменевих приладів є можливість реєстрації показань.У приладах з одним детектором промені, що виходять з двох кювет, спрямовуються на ту ж частина катода однієї лампи. За допомогою обертового непрозорого диска промені розбиваються на окремі порції. Таким чином, на детектор падає випромінювання, інтенсивність якого змінюється в межах I і I0, і його вихід змінюється з тією ж швидкістю, що і швидкість обертання диска. Це створює напругу, амплітуда якого буде пропорційна різниці в інтенсивності двох променів. Подальше вимір напруги, відповідного інтенсивності променів, залежить від конструкції приладу.Зазвичай для отримання спектрів потрібно від 0,1 до 100 мг речовини в залежності від молярного коефіцієнта поглинання. Розчини, що застосовуються в спектрофотометрії, є дуже розведеними, що обумовлює необхідність точного зважування зразка і точного відмірювання розчину при наступних розведеннях. Підходящої для вимірювань концентрацією є та, яка забезпечує показання поглинання між 0,2 і 0,7, що відповідає проникнення від 65 до 20%.Певне підвищення точності спектрофотометричного аналізу досягається шляхом, так званої диференціальної фотометрії. Цей метод заснований на порівнянні поглинання невідомого розчину і поглинання стандартного розчину, останній підібраний таким чином, що різниця в поглинаннях буде знаходитися в межах, в яких вимір може бути виконано з достатньою точністю. Диференціальний спосіб прийнятий Скандинавської фармакопеєю в якості основного методу для спектрофотометричних визначень.Відповідно до одного з варіантів диференціального методу, званого іноді ДЕ або Δε методом, вимірювання проводиться шляхом порівняння. Невідомої речовини при певній величині рН до тієї ж концентрації речовини, але при іншій, відмінній від першої, величиною рН. Наприклад, для визначення фенолів розводять частина розчину лужним, буфером, а іншу частину кислотним буфером. Вимірюють поглинання лужного розчину, використовуючи для порівняння кислотний розчин. Розраховують вміст фенолів, застосовуючи ДЕ значення, знайдене для чистої речовини в тій же парі буферних розчинів.Таким чином визначається зміст гексахлорофен в рідкому милі по Фармакопеї США XVII. Так як ряд речовин не показує змін до спектральних характеристиках при зміні рН, диференційний метод для фенолів можна вважати більш специфічним, ніж хімічний метод.

4.Фактори, що впливають на абсорбціонні властивості хромофора.

Спектр поглинання хромофора визначається в першу чергу хімічною структурою молекули. Однак λ макс. і E зазнають помітних змін і під впливом оточення . Мається на увазі вплив рН, полярності розчинника або сусідніх молекул і відносна орієнтація сусідніх хромофорів. Саме ці фактори лежать в основі використання абсорбційної спектроскопії для характеристики макромолекул.

Вплив оточення полягає в наступному:

4.1Ефект рН.

рН розчину визначає іонну форму іонізуючих хромофорів. На рис. 4-1 показаний приклад ,зображений вплив рН на спектр тирозину.

Рис.4-1.

Спектр поглинання тирозина при рН 6 і 13.Відмітим що, як λ Макс ,так і Е збільшується при дисоціації ОН-групи фенольного залишку

4.2Ефект полярності.

У разі полярних хромофорів часто справедливо (особливо якщо молекула містить О, N або S), що λ макс спостерігається при більш коротких довжинах хвиль у полярних розчинниках , що містять гідроксил (Н2О, спиртах), ніж у

неполярних. Приклад наведено на рис. 4-2.

Рис 4-2.

Вплив полярності розчинника на спектр поглинання тирозина .

4.3Ефекти орієнтації.

Величини λ макс. і Е істотно залежать від геометричних особливостей молекул. Найбільш відома гіпохромія нуклеїнових кислот, тобто зниження коефіцієнта погашеня нуклеотиду , за умови, що нуклеотид входить до складу одноланцюгового полінуклеотіду , в якому нуклеїнові основи зближені і розташовані один над одним . Подальше пониження Е спостерігається для двох спіральних полінуклеотидів , так як основи в цьому випадку ще більш впорядковані.

Це показано на рис. 4-3.В результаті досліджень великої кількості біологічно важливих з’єднань і макромолекул, структура яких добре

відома для різних умов, зібраний ряд емпіричних фактів, які можуть бути названі робочими правилами абсорбціонної спектроскопії в біохімії. Вони наведені в табл. 1

Рис 4-3.

Спектри поглинання ДНК фага Т7 в двоколірній(1) і одноколірній(2) формах ,а також після гідролізу до вільних нуклеотидів (3),що показує пониження оптичної щільності .

ТАБЛИЦЯ 1.

Емпіричні правила інтерпретації спектрів поглинання біологічних

макромолекул

1. Якщо амінокислоти; триптофан, тирозин, фенілаланін і гістидін - переміщуються в менш полярне оточення, λ макс І Е зростають.

а. Якщо в знятому в полярному розчиннику спектрі амінокислоти, знаходяться у складі білка, спостерігаються великі λ макс і Е, чим ті ж величини для вільної амінокислоти в тому ж розчиннику, то ця амінокислота знаходиться у внутрішній області білка («схована ») і оточена неполярними амінокислотами.

б. Якщо спектр білка чутливий до зміни полярності розчинника, амінокислота, для якої спостерігаються зміни λ макс і Е, повинна розташовуватися на поверхні білка.

2. У разі амінокислот