Загальна теорія поглинання світла молекулами

крива А на рис.5-3. Коли ж, навпаки, три тирозинових залишки розташовані всередині в неполярному оточенні, отримана  крива аналогічна кривій Б (правило 2а); відношення  величини першого  плата до кінцевої величини ,що дорівнює 2 / 5. Зазначимо, що при дуже високих рН на кривій видно велике зростання  D295. Це вказує на те, що внутрішні тирозинові залишки  стали доступні розчиннику, тобто білок денатурувував.

 

Криві титрування тирозина при будуванні яких використовували Е295.Гипотетичний білок складається з 5 тирозинових залишків.

А-всі 5 залишків находяться на поверхні ; Б-2 залишки на поверхні ,а 3  в середині ,в неполярному оточенні  ;В-3 внутрішніх залишки знаходяться в полярному оточенні і доступні розчиннику.Якби три внутрішніх тирозинових залишки були в полярному оточенні, то отримали б криву, схожу на криву В, яка вказує, що ці три залишки мають значення рК (правило 2в).

 

Зміна спектрів в процесі асоціації білка можуть бути викликані тим ,що хромофори розташовані на поверхності попали в площину зєднання і стали недоступні розчиннику .По спектральним випромінюванням можна контролювати наявність взаємозв’язку молекул білка і визначати  умови ,кінетику цього процесу. 

 

Рис .5-4.

Цей  процес можна вивчати з допомогою диференціальної спектроскопії; в цьому випадку для отримання диференціального спектра використовують два розчини ,які  ідентичні у всьому ,крім концентрації.

 

Заміна води на 50%-ну D2Oпризводить до характерних змін в спектрах мононуклеотидів ,та не впливає на спектри пар оснований .Таким чином ,зміни в спектрі НК в 50%-ній D2O можна використати для оприділення долі основаній ,які не беруть участі в утворенні пар .Це важливо при вивченні таких молекул ,як транспортна РНК (тРНК).В тРНК послідовність основаній така що не всі вони утворюють вуглецеві зв’язки ; можна побудувати просторові моделі,в яких реалізується частина вуглецевих зв’язків (рис.5-5).Згідно різним моделям потрібно щоб різне число основаній було зв’язане вуглецевими зв’язками ;спектральні дані дозволяють виключити деякі можливі моделі .

Рис.5-5.

Дві із декількох можливих структур алланінової  тРНК ,збудованих таким чином ,що більша частина основ бере участь в утворенні вуглецевих зв’язків .Вуглецеві зв’язки пари G*C позначена суцільною лінією ,пари А*U – точками ,більш слабшими ніж вуглецеві зв’язки ,другі пари позначенні хвилеподібною лінією . 

 

 

Площина поляризації електромагнітної хвилі визначається як площина вектора Е (мал. 14-1, див. також гл. 16, де більше повно описується поляризація і виникнення плоскополяризованого світла). Звичайний промінь світла не поляризований, тому що його можна представити як набір хвиль з випадково орієнтованими площинами поляризації. Однак плоскополяризоване світло можна отримати, або пропускаючи світло через різні речовини, або шляхом відображення від поверхні під критичним кутом. Всі хромофори мають принаймні одну вісь, вздовж якої переважно поглинається плоскополяризоване світло. Наприклад, ймовірність поглинання світла гексаметилбензолом, являючи  собою симетричне  плоске кільце максимальне, коли вектор Е знаходиться в площині кільця, і дорівнює нулю, коли він перпендикулярний цій площині. Якщо в молекулі є осі симетрії різної довжини, як у випадку плоскої молекули нафталіну,то поглинання відбувається тільки тоді, коли вектор Е лежить в площині кільця. Цей ефект називається дихроїзмом ; він визначає різні значення величини Е для окремих напрямів. Його зручно використовувати, визначаючи орієнтацію молекул в біологічних системах. При дослідженнях макромолекул він найбільш часто використовується в інфрачервоній спектроскопії для визначення орієнтації окремих зв'язків по відношенню до осі молекули. 

 

7. Інфрачервона спектроскопія 

 

 В результаті поглинання світла в ІЧ-області (від 103 до 105 нм)(Рис. 14-3) відбуваються переходи між коливальними рівнями основного стану молекули. Коливальні рівні і ІЧ.-спектри виникають за рахунок характеристичних рухів (розтягування зв'язків , зміни величини кутів між зв'язками і більш складних типів рухів) різних функціональних груп (наприклад, метильної, карбонільної, амідної і т. д.). Цінність спектрального аналізу в ІЧ-області обумовлена тим, що вид коливань кожної групи дуже чутливий до змін хімічної структури, конформації і оточення, і в цьому сенсі ІЧ-спектроскопія не відрізняється від спектроскопії у видимому й ультрафіолетовому світлі. Цей метод може застосовуватися для вивчення хімічних груп, які не можна досліджувати  з допомогою абсорбційної спектроскопії в ультрафіолетовому і видимому світлі.

 

 

Підготовка зразка для аналізу є найбільш важливим моментом при визначеннях в інфрачервоній області спектра. Адже розчинники мають характерне інфрачервоне поглинання, дещо ускладнює методику. Однак тверді речовини, які внаслідок розсіювання світла непридатні для ультрафіолетової і видимої області, широко застосовуються для інфрачервоної спектрофотометрії.

Енергія інфрачервоних фотонів на відміну від ультрафіолетової і видимої енергії незначна і структурні зміни під їх впливом зустрічаються дуже рідко.

Вимірювання поглинання в інфрачервоній області зазвичай проводять з розчинами, суспензіями в парафіновому маслі або з твердими речовинами у вигляді дисперсії з лужними галоідами.

Рідини вносять в прилад у вигляді капілярної плівки між двома пластинками кам'яної солі або в чистому вигляді в кюветі товщиною 1 мм або менше.

Тверді речовини та рідини можуть також вимірюватися в розчинах. Сірковуглець і чотирихлористий вуглець є найбільш придатними речовинами. Ці розчинники також мають