Загальна теорія поглинання світла молекулами

група (наприклад, ОН тирозину і SH цистеїну) заряджена. Отже:

а. Якщо не спостерігається змін в спектрі однієї з цих амінокислот,

а рН таке, що мала б відбуватися іонізація вільної амінокислоти, то вона повинна бути захована в неполярній області молекули білка.

б. Якщо значення рК  іонізуючої групи амінокислоти, визначене за зміни спектра при зміні рН, таке ж, як для вільної амінокислоти в розчині, то ця амінокислота знаходиться на поверхні білка.

в. Якщо значення рК, визначене за зміни спектра при зміні рН, істотно інше, то ця амінокислота, ймовірно, знаходиться в дуже полярному оточенні (наприклад, тирозин, оточений карбоксильними групами).

3. Величина Е пуринів і піримідинів знижується у міру того, як плоскості їх кілець стають паралельними і кільця зближуються один з другим . Величина Е знижується в наступному ряді : вільна основа > основа в складі одноланцюгового  полінуклеотида, що не має сгекінга > основу в складі одноланцюгового  полінуклеотиду зі стекінгом >  основа у складі двохланцюгового полінуклеотида.

 

 

Вимірювання поглинання проводиться для багатьох цілей: визначення  концентрації речовини, аналізу деяких хімічних реакцій, ідентифікації речовин та визначення структурних параметрів макромолекул. Всі ці галузі застосування розглядаються в наступних прикладах.

 

Найбільш часто через вимірювання поглинання проводять для визначення концентрації .Це можна робити, якщо відомий молярний коефіцієнт погашення і дотримується закон Бера. Наприклад, для двохланцюгового  ДНК D260 = 1 відповідає 50 мкг / мл (ця величина залежить від нуклеотидного складу) . Оскільки закон Бера дотримується

принаймні до D = 2 (яка наближається до межі для більшості спектрофотометрів), легко підрахувати концентрацію, а саме: D, рівна 0,5, відповідає 25 мкг / мл, D, рав-_

ная 0,1, відповідає 5 мкг / мл і т. д.

Іноді досліджуваний матеріал складається з частинок, поглинаючого світла  і утворюють швидше суспензію, ніж розчин; наприклад : у разі бактеріофагів, поглинання майже цілком визначається вмістом у них ДНК .Бактеріофаги не тільки поглинають , але також й розсіюють світло (релляївське  розсіювання) і,

отже, можуть мати штучно завищене поглинання. Однак, вимірюючи поглинання при ряді довжин хвиль, далеких

від λ макс, можна зробити поправку на розсіювання. Так як розсіяння змінюється пропорційно λ -4, можна побудувати залежність вимірюваного поглинання від λ -4 і, екстраполюючи лінійну частину цієї кривої (де все спостережуване поглинання обумовлене розсіюванням) до λ макс, внести поправку в вимірюване поглинання, що дорівнює величині, обумовленої розсіюванням. Приклад такої поправки зображений на рис. 5.

 

 Рис. 5.

Це зручний метод визначення вмісту нуклеїнової кислоти в бактеріофага; враховується також те, що D260 (з поправкою на розсіювання) = 1

відповідає концентрації ДНК 50 мкг / мл.

Концентрацію бактерій також часто визначають спектрофотометричним методом , хоча при використовуваних довжинах хвиль все поглинання обумовлено розсіюванням. У цьому випадку замість поправки на розсіювання проводиться співставлення спостережуваної  оптичної щільності з кількістю життєздатних клітин

і будується калібрувальна крива. Таким шляхом, як показано  на рис. 5-1, вдається точно визначити концентрацію клітин або сухої маси на одиницю об'єму.

 

Рис .5-1.Концентрація бактерій , визначена  шляхом вимірювання оптичної щільності .

 

В ході реакції має змінюватися поглинання одного із реагентів. Розглянемо вимір активності ферменту-галактозидази. Ця методика широко використовується в молекулярній біології при вивченні функціонування лактозного оперону. Цей фермент розщеплює 0-нітрофенілгалактозид (ОНФГ) з утворенням о-нітробензолу, який можна визначити за його поглинання при 420 нм. Так як, в деякому інтервалі, швидкість реакції пропорційна концентрації ферменту, з нахилу кривої залежності D від часу гідролізу (рис. 5-2) можна визначити кількість

ферменту. 

  

Рис. 5-2 .Час після додавання стимулятора.

 

Вивчення синтезу  -галактозидази шляхом вимірювання D420 продукту гідролізу о-нітрофенілгалактозида (ОНФГ). Три культури : Lac-,Lac+   і диплоїд ,містить дві копії генів lас, вирощувалися в  гліцерин-сольовому  середовищі.При t = O був доданий стимулятор синтезу  -галактозидази. Через відмінні проміжки часу брали проби і обробляли толуолом для того,щоб вбити клітини і відокремити фермент, потім був доданий ОНФГ. Через тридцять хвилин була виміряна D420. У результаті цього досвіду показано, що клітини Lac-не продукують фермент, а диплоїд продукує приблизно в два рази більше, ніж гаплоїди.

 

При багатьох дослідженнях структури білків виникає необхідність визначення величини рК дисоціації протонів іонізуючих бічних груп амінокислот, оскільки ці величини вказують на локалізаuію амінокислоти у білку (правило 2  в табл. 14-2). Це часто можна зробити спектрофотометрично, так як при  дисоціації  часто змінюється спектр одного з хромофорів (наприклад, у випадку тирозину).Розглянемо  гіпотетичний тирозиновмістимий  білок і для визначеня числа зовнішніх тирозинових залишків скористаємося правилом 2 (табл. 14-2). Припустимо, що в цьому білку міститься п'ять тирозинових залишків. Якщо всі вони розташовані на

поверхні і іонізуются при збільшенні рН, спектр, відповідаючим  залишками тирозину, буде наближатися до спектру вільного  тирозину при високих значеннях рН, (правило 2 б). Іншими словами, залежність D295

(λ макс