Бактеріальні хвороби плодових культур Закарпатської області

З пухлин і тканин ксилеми бактерії виділяють таким чином: невеликий шматочок ксилеми, промитої з поверхні, занурюють у спирт і підпалюють його. Спирт горить 1-2 сек., після чого поверхність стає стерильною. Для поверхневої стерилізації можна використовувати також 0,5%-вий розчин Хлорокса. Бактеріальний препарат з мацерованої знебарвленої тканини або живої тканини готовий для дослідження. 

Аналогічні методи стерилізації та виділення патогена можуть бути використані при вивченні тих уражень, збудник яких знаходиться під насіннєвою оболонкою (наприклад, при захворюваннях квасолі). Якщо ж патоген поселяється па поверхні насіннєвої оболонки (при захворюваннях гороху або томатів), то проводити поверхневу стерилізацію не можна [19].

Мікроскопічне дослідження ураженої рослини.

Дослідження бактеріальних уражень рослин під микроскопом не дає достатньої інформації. Часто подібне вивчення рослинного матеріалу не дозволяє навіть визначити, чи є дане захворювання бактеріальним за походженням. Причина цього полягає в тому, що при такому дослідженні бактеріальні клітини часто можна сплутати з окремими клітинами рослини, зернами крохмалю і хлорофілу. Бактеріальні клітини, що містяться в рослині, часто не мають навіть тієї форми, яка притаманна їм при культивуванні на штучних поживних середовищах. Вони меншого розміру і неправильної палочковидної форми. Бактерії , що виявляються в препаратах зі старих плям виразки, втрачають свою рухливість. Значно легше вивчати бактерії з молодих уражених ділянок листка. На пізніх стадіях розвитку захворювання мікроскопічну картину дуже спотворює присутність сапрофітних мікроорганізмів, оскільки під мікроскопом їх неможливо відрізнити від фітопатогенних. Тому мікроскопічне дослідження служить лише для отримання загальної інформації про причину захворювання. Таке вивчення набуває значно важливіше значення при фарбуванні тканин, коли бактерії стають різко відмінними за забарвленням від здорових і уражених тканин рослини [16].

Мікроскопічне дослідження уражених тканин з використанням забарвлених зрізів (диференційне фарбування). При вивченні деяких зразків ураженого рослинного матеріалу, таких як стебло або шкірястий листок, зрізи можна приготувати, використовуючи гостру бритву. Тонкі зрізи готують з уражених тканин рослини, укладаючи їх між шматочками писушеної серцевини рослини бузини. Перед використанням край бритви змочують спиртом і отримані зрізи поміщають у воду. Метод диференційного фарбування по Стоутону: 

1.Фарбування карболтіоніном 5 хв (0,1г тіоніна синього на 100мл 5%ного фенолу, що містить дистильовану воду). 

2.Промивання у воді.

3. Перенесення в 95%-ний спирт. 

4. Диференційне фарбування Оранжем G на протязі кількох хвилин. (Оранж G розчинений в абсолютному спирті.) 

5. Промивання тканин абсолютним спиртом [19].

6. Після перенесення в ксилол зріз накривають покривним склом і поміщують в бальзам. 

У готовому забарвленому препараті бактеріальніклітини темно-синього кольору, стінки клітин целюлози – жовті або зелені, лігніфіковані тканини – світло-сині [19].

Отримання чистих культур. Виділення патогeнів проводять на щільних середовищах. Після розливу їх і застигання в чашках Петрі чашки слід деякий час підсушити перед посівом бактерій. Це сприяє виділенню конденсаційної вологи, яка осідає на поверхні середовищ. Ці краплі конденсату не дають можливості отримати ізольовані колонії, так як бактерії плавають в них. Поверхня чашок Петрі з агаром підсушується 30 хв. при 50°С. Металевою петлею бактерії наносять штрихом на поверхню агару в чашках. На стерильному предметному склі готують суспепзію бактерій із заражених рослинних тканин. 

Для отримання ізольованих колоній бактеріальну суспензію найкраще наносити штрихом. Спочатку петлю занурюють у суспензії бактерій і на поверхні чашки Петрі зліва направо наносять 5 штрихів. Потім петлю вносять в помум’я пальника і, повернувши чашку на 90°, роблять зправа на ліво ще 5 штрихів. Потім чашку знову повертають праворуч на 90° і роблять штрихи справа наліво. При цьому досягається таке разведеня суспензії, при якому виростають окремі колонії бактерій. Після 48-72год інкубації при 28°С різні типи колоній переносять в пробірки зі скошеним агаром. При вивченні бактеріальних культур, ізольованих з уражених рослинних тканин, звичайно досліджують морфологію клітин і колоній, біохімічні і патологічні методи [19].

Ідентифікація патогенна. Через морфологічні особливості бактерій для їх вивчення не завжди можуть бути використані методи, що застосовуються в мікології. Оскільки визначення грибів і вищих рослин основане на їх морфолог них ознаках, незначні морфологічні відмінності між окремими видами бактерій роблять можливим використанням цих же методів у мікробіoлогії. Деякі фітопатогенні бактерії настільки схожі, що їх не можна розрізнити, використовуючи тільки класичні методи ідентифікації. Для визначення патогенних бактерій використовують наступні критерії:

1)тест на патотснность для відбору патогенного ізолята; 

2)вивчення морфології бактеріальної клітини і колонії; 

3)визначення фізіологічних і біохімічних властивостей бактерій; 

4)дослідження патогенності для визначення кола господарів [8].

Тест на патогенність для відбору патогенного ізолята. Найкраще спочатку виконати просте і швидке дослідження патогенності бактерій, так як згодом потрібно вивчати біохімію лише тих культур, патогенність яких доведена. Визначити патогенність культури можна протягом 24год, використовуючи метод інфікації Клемента. Він грунтується на реакції надчутливості рослин.

Культури бактерій, отримані після ізоляції, беруться з чашок і суспендується в стерильній водопровідній воді. Число бактеріальних клітин в 1мл такої суспензії,