Мінливість продуцента літичних ферментів Streptomyces recifensis var. Lyticus та його селекція

Національна академія наук України

Інститут мікробіології та вірусології ім. Д. К. Заболотного

 

Жерносєкова Ірина Володимирівна

 

УДК 576. 8. 095. 58+579. 873. 71+577. 15

 

 

03. 00. 07 – мікробіологія

  

Автореферат

Дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

 

Київ – 2002

 

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Науково-дослідному інституті біології Дніпропетровського національного університету.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Вінніков Альберт Іванович, Дніпропетровський національний університет, завідувач кафедри мікробіології та вірусології.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Захарова Ірина Яківна, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України, науковий консультант відділу біохімії мікроорганізмів кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Колтукова Наталія Володимирівна, Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л. В. Громашевського АМН України, старший науковий співробітник відділу загальної мікробіології.

Провідна установа: Київський національний університет імені Тараса Шевченка.

Захист відбудеться “20” березня 2002 року о 1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26. 233. 01 при Інституті мікробіології та вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. Заболотного, б. 154, ІМВ ім. Д. К. Заболотного.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології та вірусології ім. Д. К. Заболотного.

Автореферат розісланий ”20” лютого 2002 р.

 

Актуальність теми. Ферментні препарати знайшли широке застосування в різних галузях народного господарства. В останні десятиріччя інтенсивно вивчаються літичні ферменти, можливість їх виготовлення та практичного застосування. За кордоном випускається ряд препаратів, які відрізняються специфічністю та направленістю своєї дії. Літичні ферменти ефективно використовуються в науково-дослідних роботах, при вирішенні ряду біотехнологічних процесів, а також перспективні в якості хіміопрепаратів в медичній та ветеринарній практиці.

Розширення асортименту випускаємих препаратів буде сприяти їх широкому застосуванню при вирішенні багатьох питань теоретичного та практичного характеру. В зв'язку з цим актуальними залишаються дослідження, присвячені пошуку нових продуцентів, вивченню складу літичних комплексів та їх механізму дії, розробці умов ферментації та виготовлення нових препаратів з заданими властивостями.

Співробітниками НДІ біології та кафедри мікробіології і вірусології Дніпропетровського університету вивчаються літичні ферменти стрептоміцетів. Відібрано перспективний продуцент з широким спектром бактеріолітичної дії. На основі біосинтезу Streptomyces recifensis var. lyticus розроблено засіб виготовлення нового препарату літичних ферментів.

Для впровадження в виробництво нових препаратів актуальними є дослідження, присвячені селекції продуцента, оптимізації ферментаційних середовищ та умов культивування, пошуку засобів збереження високої активності селекціонованих штамів.

Мета та задачі дослідження. Мета даної роботи складалась з дослідження мінливості S. recifensis var. lyticus та підвищення його літичної активності на основі відбору рифампіциностійких мутантів.

В задачі досліджень входило вирішення таких питань:

– вивчення спонтанної мінливості батьківського штаму 2435 за морфологічними ознаками та літичною активністю;

– встановлення принципової можливості застосування рифампіцину в селекції продуцента літичних ферментів та для стабілізації високої активності селекціонованих штамів;

– проведення ступінчатої селекції та відбір високоактивного штаму;

– оптимізація ферментаційного середовища на основі методу математичного планування експерименту;

– встановлення впливу глюкози на синтез бактеріолітичних ферментів у селекціонованого штаму;

– порівняльне дослідження ряду біологічних властивостей та складу бактеріолітичних комплексів селекціонованого та батьківського штамів.

Об’єкт дослідження. Штами S. recifensis var. lyticus 2435 та П-29 – продуценти літичних ферментів.

Предмет дослідження. Відбір високоактивного рифампіциностійкого мутанту, стабілізація біосинтетичної активності.

Методи дослідження. Мікробіологічні – для проведення селекції; біохімічні – для оцінки ферментативних активностей та характеристики ферментних комплексів; математичні – для оптимізації ферментативних середовищ; статистичні – для аналізу та достовірної оцінки отриманих результатів.

Наукова новизна роботи. Отримано нові дані про можливість застосування рифампіцину в селекції продуцентів екстрацелюлярних ферментів. Вперше показано, що рифампіцин, внесений в оптимальних концентраціях в агаризоване середовище вирощування, здатний стабілізувати літичну активність селекціонованих штамів.

Відібрано новий рифампіциностійкий штам 2Р-15. Встановлено, що висока його активність обумовлена збільшенням показника середньої літичної активності клонів, значним накопиченням в популяції плюс-варіантів та рифампіциностійких мутантів, зниженням коефіцієнту мінливості. Одержано дані про зниження його чутливості до інгибуючої дії глюкози.

Ферментний комплекс штаму 2Р-15 втратив дріжджелітичну активність. На основі даних іонообмінної хроматографії встановлено, що в пулі його екстрацелюлярних білків зросла частка літичних протеаз, виявлено більшу їх кількість та зростання питомої активності.

Практичне значення роботи полягає в тому, що в результаті трьохступінчатої селекції відібрано мутантний штам 2Р-15, перспективний для промислового виробництва нового препарату літичних ферментів. Його літична активність порівняно з батьківським штамом відносно клітин Staphylococcus aureus збільшилась в 2, 5 рази та Micrococcus lysodeikticus – в 5 разів.

Встановлено можливість підвищення ефективності відбору перспективних клонів по зонам деградації субстрату при використанні модифікованого нами індикаторного середовища. Отримано нові варіанти ферментаційного середовища на основі оптимізації кількісного вмісту компонентів, які забезпечили високу літичну активність рифампіциностійких мутантів.

Встановлено можливість збільшення лізуючої активності ферментних препаратів при сумісному їх використанні з поверхнево-активною речовиною – етонієм.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Представлені в дисертації результати