Мінливість продуцента літичних ферментів Streptomyces recifensis var. Lyticus та його селекція

Проведені нами дослідження свідчать про те, що зниження літичної активності штаму 2435 відносно S. aureus та інших тест-культур відбувається тому, що з їх популяцій витісняються варіанти 1-го типу за рахунок зростання менш активних варіантів 2-го типу. На основі отриманих даних відбір найбільш активних колоній 1-го морфологічного типу по розміру зон деградації субстрату, виявлених на індикаторному середовищі, ефективно використовували при стабілізації активності батьківського штаму 2435, а також на всіх етапах його селекції.

Селекція продуцента літичних ферментів s. Recifensis var. Lyticus

При селекції продуцента літичних ферментів у якості вихідного штаму було використано штам П-29, відібраний раніше із числа найбільш активних регенерантів. Штам виявив значну нестабільність – його стафілолітична активність при лабораторному вирощуванні знизилась з 3500 од/мл до 250 – 300 од/мл. В експериментах вивчали принципову можливість та ефективність застосування рифампіцину для відбору високоактивних регуляторних мутантів серед антибіотикостійких клонів. Літичну активність природних варіантів та рифампіциностійких мутантів визначали по розміру зон лізису субстрату і виражали її в відсотках від контролю. З цією метою колонії 1-го морфологічного типу відсівали на модифіковане індикаторне середовище, зони вимірювали через три доби вирощування при 28С.

Встановлено, що майже у 90% варіантів штаму П-29 літична активність коливається в досить вузьких межах – від 70 до 130%. В популяції виявлено 11, 9% неактивних варіантів, що знижує показник середньої активності. Летальний ефект рифампіцину залежить від його концентрації в живильному середовищі: при її збільшенні від 6 до 14 мкг/мл виживаємість спор знижується з 6, 1 до 0, 02%. У мутантів, стійких до 10 – 14 мкг/мл антибіотика, розширюються межі мінливості, коефіцієнти варіацій зростають до 27, 6 – 27, 9 проти 19, 7% в контрольному розсіві. Серед мутантів, стійких до 14 мкг/мл рифампіцину, виявлено зростання мінус-варіантів до 21, 5% та плюс-варіантів – до 10% проти 2, 4% в контролі (табл. 3).

На першому ступені використання рифампіцину із великої кількості клонів було відібрано 30, у більшості з них в умовах глибинної ферментації активність перевищувала вихідний штам П-29 на 20-100%, проте рівень активності навіть найкращих варіантів досягав лише 500 – 600 од/мл. Враховуючи дані літератури можна припустити, що низька активність штаму П-29 та відібраних мутантів пов'язана з суттєвими змінами їх геному, які виникають часто в результаті протопластування та регенерації.

 

Таблиця 3

Показники популяційної мінливості колоній по рівню літичної активності штаму П-29 та його рифампіциностійких мутантів

 

Варіанти Концентрація рифампіцину, мкг/мл Виживаємість спор, % Число варіантів (n) Літична активність, % від К  (  m) 

Коефіцієнт варіацій (СV) Межі мінливості ( 2) 

Частота, % 

плюс-варіанти мінус-варіанти

Природні (контроль) 0 100 84 86, 41, 8 19, 7 52, 4-120, 4 2, 41, 7 11, 93, 5

 

Рифампіциностійкі 6-8 6, 1-4, 7 98 89, 51, 7 19, 4 54, 7-124, 2 2, 01, 4 14, 33, 5

10-12 1, 7-0, 9 70 80, 32, 7 27, 9 35, 5-125, 1 2, 81, 4 17, 14, 5

14 0, 02 70 83, 92, 8 27, 6 37, 5-130, 3 10, 03, 6 21, 54, 9

 

Відомо, що у мікроорганізмів біосинтез метаболітів тісно пов'язаний з енергетичним обміном. В попередніх дослідах нами було встановлено, що підвищення концентрації глюкози від 0, 2 до 1, 4% збільшує активність штамів в 4 – 8, 8 разів. При оптимізації середовища вміст глюкози в ньому було збільшено до 0, 66% проти 0, 07% в вихідному середовищі. На новому варіанті ферментаційного середовища (ФС-2) активність штаму П-29 досягла рівня 2000 – 2200 од/мл, а у більшості відібраних рифампіциностійких мутантів – 3000 – 4200 од/мл, що перевищує контроль на 50 – 110%.

На слідуючому ступені селекції в якості вихідних було використано штами 1Р-92 та 1Р-232, відібрані з клонів, стійких до 10 та 14 мкг/мл рифампіцину. При порівняльних дослідженнях мінливості варіантів моноспорового розсіву по літичній активності та впливу рифампіцину встановлено, що в їх популяціях, на відміну від штаму П-29, неактивні варіанти відсутні, показники середньої активності зросли до 1051, 9 та 113, 31, 2 проти 86, 41, 8%, межі мінливості природних варіантів змістилися в сторону більших величин (рис. 1).

При близькій літичній активності вплив рифампіцину на їх спори відрізняється. Так, для штаму 1Р-92 концентрації антибіотика 12 та 16 мкг/мл вже токсичні, на що вказує зниження показників середньої активності у рифампіциностійких мутантів до 95, 62, 0 – 85, 04, 1 проти 1051, 9%, встановленого для природних варіантів, а також значне зростання частоти виникнення мінус-варіантів.

Слід відзначити, що в популяції штаму 1Р-232, порівняно зі штамом 1Р-92, на 1-2 порядки більше резистентних спор, рівень їх стійкості вищий. Відносно спор цього штаму не виявлено негативного впливу навіть більших концентрацій (16 – 20 мкг/мл) антибіотика. Більш того, середні показники їх літичної активності зросли, межі