Мінливість продуцента літичних ферментів Streptomyces recifensis var. Lyticus та його селекція

Нами встановлено, що для штамів 1Р-232 та 2Р-15, які походять від більш стійких клонів (14 мкг/мл проти 10 мкг/мл для штама 1Р-92), для стабілізації оптимальною являється концентрація 10 мкг/мл. Отримані результати було використано для довгого збереження активності селекціонованого штаму 2Р-15, культури якого вирощували на середовищі Гаузе 1 з оптимальною для нього концентрацією (10 мкг/мл) рифампіцину та зберігали їх в рефрижераторі при – 20С.

Отримані дані свідчать, що рифампіцин може бути ефективно використаним не тільки в селекції продуцентів ферментів, а й для стабілізації високої активності у селекціонованих штамів.

Таким чином, на основі проведених досліджень в результаті трьохступінчатої селекції нами відібрано мутантний штам 2Р-15, перспективний для промислового виробництва нового лізоензимного препарату.

Практичне значення мають також отримані дані про можливість підвищення лізуючої активності ферментних препаратів, особливо при роботі з важколізуємими мікроорганізмами та густими їх суспензіями. В плані пошуку нових речовин, здатних збільшувати ферментативний лізис клітин стафілокока, нашу увагу привернув етоній.

Було проведено порівняльне дослідження ряда зразків ферментного препарату Г10х, отриманих в дослідно-промислових умовах, після зберігання протягом 2-4-х років при кімнатній температурі. Встановлено, що їх стафілолітична активність в присутності оптимальної концентрації етонію (2, 5 мг%) в реакційній системі зростає в 2, 6-4, 5 разів і перевищує, як правило, вихідну активність. Етоній збільшує літичну активність в 1, 6 разів і свіжевиготовлених лабораторних зразків ацетонового препарату (табл. 5).

 

Таблиця 5

Вплив етонію на рівень стафілолітичної активності ряду зразків препарату Г10х, одержаних в дослідно-промислових та лабораторних умовах

Партія

препарату

Номер зразка Літична активність, од/г

Коефіцієнт

різниці

 

вихідна після збереження

без етонію (К) з етонієм

I 1 100000 57000 147000 2, 6

2 100000 58000 240000 4, 1

3 50000 37000 100000 2, 7

II 1 130000 40000 173000 4, 3

2 50000 11000 49000 4, 5

III лабораторний 4100* - 6600* 1, 6

* Літична активність визначена в од/мг білка

Встановлено також можливість використання розчинів етонію для попередньої обробки густих (10% -них) суспензій стафілокока – чутливість їх клітин значно зростає до лізуючої дії досліджуємого ферментного препарату. Підібрані умови при яких активність лізису 10% -них суспензій стафілокока досягає 90% за 30 хвилин при 37С.

Можливо припустити також, що етоній при сумісному його використанні з препаратами літичних ферментів буде збільшувати їх хіміотерапевтичну активність як при стафілококових, так і змішаних інфекціях.

 

Дослідження деяких біологічних особливостей мутантів, відібраних в ході селекції

 

В результаті трьох ступенів селекції стафілолітична активність продуцента S. recifensis var. lyticus 2435 зросла від 2200 – 2500 до 5800 – 6300 од/мл. В ході селекції для відібраного регенеранта П-29, рифампіциностійких мутантів та селекціонованого штаму 2Р-15 виникла необхідність поступового збільшення вмісту глюкози в ферментаційному середовищі, що вказує на певні зміни у них енергетичного обміну. В зв'язку з цим було проведено порівняльні дослідження чутливості синтезу бактеріолітичних ферментів до інгибуючої дії глюкози у штамів П-29 та 2Р-15. Раніше було встановлено, що батьківський штам 2435 відрізняється дуже високою чутливістю до катаболітної репресії, оптимальна для нього концентрація глюкози в середовищі 0, 07% (Кілочок, 1988).

Досліджуємі штами П-29 та 2Р-15 значно відрізняються між собою по стафілолітичній та глікозидазній активності. Так, на середовищі ФС-2 з вмістом 0, 66% глюкози активність штаму П-29 відносно S. aureus та M. lysodeikticus досягала 1800 та 3500 од/мл, штаму 2Р-15 – відповідно 3800 та 6500 од/мл (рис. 4 а, б). При дослідженні впливу зростаючих (від 1 до 5%) концентрацій глюкози на рівень літичної активності відносно тих же тест-культур було встановлено, що у штаму П-29 синтез стафілолізинів хоч трохи і знижується при 2% глюкози, але залишається на тому ж рівні при подальшому збільшенні її концентрації. Що стосується глікозидаз, то їх інгибування також, як і у батьківського штаму 2435, зростає при збільшенні вмісту глюкози в ферментаційному середовищі (рис. 4в). Значно більше виражені ці зміни у штаму 2Р-15: слабе пригнічення синтезу стафілолізинів порівняно з контролем спостерігається також при 2% глюкози, тоді як глікозидаз – тільки при 4%. При зростанні концентрації глюкози збільшення її інгибуючої дії не спостерігається ні відносно стафілолізинів, ні відносно глікозидаз (рис. 4г). Отримані дані свідчать про те, що у відібраного нами штаму 2Р-15 чутливість до інгибуючої дії глюкози значно знизилась. Його висока біосинтетична активність виявляється на середовищах з більшим вмістом глюкози (оптимальна її концентрація 1, 1%).

З метою одержання більш повної характеристики селекціонованого штаму 2Р-15 були проведені дослідження закономірностей його росту та біосинтезу екстрацелюлярних ферментів порівняно з батьківським (2435) та вихідним (П-29) штамами (рис. 5). Встановлено, що на ферментаційних середовищах з оптимальними концентраціями глюкози досліджуємі штами мають схожу динаміку росту та біосинтезу різних груп ферментів. Штам 2Р-15 відрізняється самою високою швидкістю росту протягом всієї log-фази, включаючи період її затримки, та самим високим рівнем накопичення біомаси.