Мінливість продуцента літичних ферментів Streptomyces recifensis var. Lyticus та його селекція

Слід відмітити, що в ході селекції уже у штаму П-29 після регенерації протопластів було значно знижено, а потім втрачено дріжджелітичну активність. У штаму 2Р-15 дріжджелітична активність також відсутня. При дослідженні бактеріолітичного комплексу штаму 2Р-15 виявлені як кількісні, так і якісні зміни його складу порівняно з батьківським штамом 2435. Фракціонування ферментного комплексу штаму 2Р-15, осадженого з культуральної рідини ацетоном, проводили на катіонообміннику КМ-серадекс С-50 (рис. 6). Звертає на себе увагу, що протеолітичні ферменти з казеінолітичною активністю розподілені по всьому профілю елюції білка. В зоні градієнтної елюції виявлено 11 піків стафілолітичної активності. Вони мають різний рівень активності, а також в тій чи іншій мірі – казеінолітичну. Слід відмітити, що фракції I-V мутантного штаму 2Р-15 виявлені при тих же значеннях градієнту елюції (0, 4 – 0, 6 М буфера), як і ендопептидази батьківського штаму 2435. Їх питома літична активність в 2, 5 – 7 разів вища і характеризується рівнями 10000 – 28000 од/мг білка. В загальному пулі екстрацелюлярних білків штаму 2Р-15 зросла частка літичних ферментів з 10 до 23, 7%.

Одержані дані свідчать про те, що у мутантного штаму 2Р-15 висока бактеріолітична активність обумовлена зростанням потреби в глюкозі, зниженням чутливості до інгибуючої її дії, збільшенням кількості літичних протеаз та зростанням їх питомої активності.

Таким чином, на підставі результатів власних досліджень можна зробити висновок, що використані нами рифампіцин для відбору мутантів та попередня оцінка активності різних клонів сприяли зниженню трудоємкості селекції, а відібраний високоактивний мутант 2Р-15 являється перспективним в плані створення на його основі промислового виробництва нового препарату літичних ферментів, який відрізняється широким спектром лізуючої дії та рістстимулюючими та імунотропними властивостями.

 

 

1. У продуцента Streptomyces recifensis var. lyticus встановлено взаємозв’язок між морфологічною мінливістю та літичною активністю, яка залежить від вмісту в популяції варіантів 1-го морфологічного типу.

2. Показано принципову можливість застосування рифампіцину в селекції продуцента, а також здатність його при внесенні в агаризоване середовище – стабілізувати літичну активність рифампіциностійких мутантів.

3. В результаті трьохступінчатої селекції отримано штам 2Р-15, активність якого, порівняно з батьківським штамом, відносно клітин Staphylococcus aureus та Micrococcus lysodeikticus зросла в 2, 5 та 5 разів.

4. Штам 2Р-15 характеризується збільшенням кількості антибіотикостійких спор в популяції (на 2, 0-2, 5 порядка), показника середньої літичної активності клонів (в 1, 4 рази), плюс-варіантів (до 45, 4%), зниженням коефіцієнту мінливості (до 13, 5%).

5. На основі методу математичного планування експерименту проведено оптимізацію ферментаційного середовища. Отримано два нових його варіанта, які забезпечили збільшення літичної активності відбираємих мутантів в 7-10 разів.

6. У селекціонованого штаму 2Р-15 порівняно з батьківським штамом знижено чутливість до інгибуючої дії глюкози в 3-4 рази.

7. Встановлено, що в процесі селекції мутантний штам 2Р-15 втратив дріжджелітичну активність. В пулі його екстрацелюлярних білків збільшилась частка та кількість літичних протеаз (від 5 у батьківського штаму до 11), а також питома їх активність.

 

 

1. Жерносекова И. В., Кукушкина Н. В., Бабенко Ю. С. Влияние этония на активность лизиса клеток стафилококка ферментным препаратом Streptomyces recifensis var. lyticus 2435 //Антибиотики и химиотерапия. – 1990. – 35, № 11. – С. 10-13.

2. Жерносекова И. В., Килочек Т. П., Бабенко Ю. С., Винников А. И. Увеличение активности литических ферментов у рифампициноустойчивых мутантов Streptomyces recifensis var. lyticus // Мікробіол. журн. – 1999. – 61, №2. – С. 15-24..

3. Жерносекова И. В., Килочек Т. П. Влияние глюкозы на биосинтез экстрацеллюлярных ферментов Streptomyces recifensis var. lyticus и его мутантами // Мікробіол. журн. – 2000. – 62, №2. – С. 19-26.

4. Жерносекова И. В., Соколова И. Е., Килочек Т. П., Черногор Н. П. Характеристика бактериолитического ферментного комплекса рифампициноустойчивого мутанта Streptomyces recifensis var. lyticus 2Р-15 // Бюлетень інституту сільськогосподарської мікробіології. – Чернігів, 2000. – №7. – С. 31-32.

5. Куликова Т. Я., Жерносекова И. В. Селекция продуцента литических ферментов с использованием методов протопластирования и отбора рифампициноустойчивых мутантов // Мікробіол. журн. – 1994. – 56, №2. – С. 76.

6. Килочек Т. П., Жерносекова И. В. Оптимизация питательной среды для биосинтеза комплекса экстрацеллюлярных ферментов Streptomyces recifensis var. lyticus // Микроорганизмы и их метаболиты в народном хозяйстве. Тез. докл. III-ей интерн. конф. – Кишинев, 1996. – С. 18-19.

7. Соколова И. Е., Жерносекова И. В. Состав внеклеточных ферментов у рифампициноустойчивого варианта Streptomyces recifensis var. lyticus // V Міжнародна конф. Франція та Україна. Тези доповідей. – Дніпропетровськ, 1998. – 2, ч. ІІІ. – С. 98-99.

8. Бабенко Ю. С., Килочек Т. П., Черногор Н. П., Соколова И. Е., Жерносекова И. В. Лизорецифин – новый биопрепарат с антимикробным, ростстимулирующим действием и перспективы его практического использования