Мінливість продуцента літичних ферментів Streptomyces recifensis var. Lyticus та його селекція

Дослідження природної мінливості S. recifensis var. lyticus 2435 проводили по схемі, заснованій на врахуванні змін морфолого-культуральних властивостей варіантів колоній та визначенні їх активностей (Кузнецов, 1972). Літичну активність різних типів колоній оцінювали по розмірам зон деградації клітин стафілокока, внесених в голодне середовище Гаузе 1, та виражали у відсотках від контролю.

В селекції продуцента літичних ферментів з метою відбору регуляторних мутантів використовували рифампіцин, який вносили в середовище Гаузе 1 в концентрації від 6 до 20 мкг/мл. При вивченні мінливості по рівню літичної активності кожного досліджуємого штаму, а також мутантів, стійких до різних концентрацій рифампіцину, колонії 1-го морфологічного типу відсівали уколом на індикаторне середовище, чутливість якого було збільшено за рахунок використання двох шарів: нижній – повноцінне середовище Гаузе 1, верхній – 1% -ний агар з субстратом. У відібраних варіантів визначали літичну активність в умовах глибинної ферментації.

Вплив рифампіцину на стабілізацію високої активності вивчали на двох відібраних мутантах 1Р-92 та 1Р-232, культури яких послідовно пересівали на середовище Гаузе 1 без антибіотика та з внесенням його в різних концентраціях (5, 0; 7, 5; 10 мкг/мл). Літичну активність субкультур визначали в од/мл та виражали її у відсотках від активності вихідних культур досліджуємих штамів.

Статистичну обробку експериментальних даних при малих вибірках проводили за Кокуніним (1975) з використанням коефіцієнту Ст’юдента. При великих вибірках використовували більш економічні засоби обчислень  , , m – засіб сум (Плохінський, 1970).

Спонтанна мінливість продуцентА літичних

ферментів S. recifensis var. lyticus 2435

Популяційну мінливість батьківського штаму 2435 вивчали за морфологічними ознаками колоній та їх активністю, що має практичне значення для селекції. Встановлено, що популяція зрілих культур при моноспорових розсівах на різних середовищах представлена двома близькими морфологічними типами колоній: до 1-го типу віднесено колонії круглі, випуклі з рівними краями та валиком по периферії, сіруватим міцелієм; до 2-го – колонії з бугристою поверхнею, хвилястими краями та білісуватим забарвленням повітряного міцелію. Серед них зустрічаються і атипічні колонії, які віднесено до 3-го типу.

Саму високу морфологічну мінливість штаму 2435 виявлено на модифікованому середовищі Чапека, саму низьку – при пересівах на середовищах Гаузе 1 з крохмалем або глюкозою. На цих середовищах в популяції збільшується кількість варіантів 1-го типу з 83, 3 до 94, 0%, а кількість атипічних колоній зменшується з 8, 9 до 0, 2% (Табл. 1).

 

Таблиця 1

Мінливість штаму 2435 та його морфологічних варіантів при вирощуванні на різних живильних середовищах

Досліджуєма

культура Середовище

вирощування Склад популяції (%) 

1-й тип 2-й тип 3-й тип

Чапека модифіковане 83, 3 7, 8 8, 9

Вихідний штам Гаузе 1 з глюкозою 92, 6 7, 0 0, 4

Гаузе 1 з крохмалем 94, 0 5, 8 0, 2

1-й морфологічний тип те саме 96, 1 3, 7 0, 2

2-й морфологічний тип -  - 32, 5 65, 0 2, 5

3-й морфологічний тип -  - 0 0 100

 

Активність варіантів 1-го та 2-го морфологічних типів визначали по розміру зон лізису клітин стафілокока, внесених в індикаторне середовище, і виражали її в відсотках від контролю. Встановлено, що більшу активність мають варіанти 1-го типу. У варіантів 2-го типу показник середньої літичної активності знижено з 82, 3 до 65, 7%, межі мінливості зміщено в сторону менших значень, а коефіцієнт варіацій значно збільшено (Табл. 2). Отримані дані були підтверджені при виборочній перевірці активності культур різних морфологічних типів в умовах глибинного вирощування.

 

Таблиця 2

Показники мінливості стафілолітичної активності у варіантів основних морфологічних типів штаму 2435

Морфоло-

гічний тип Активність,

% від контролю,  m

Коефіцієнт варіації,

% Межі

мінливості,

 2

Частота, % 

плюс-

варіанти мінус-

варіанти

1-ий 82, 32, 4 23, 1 42, 5 – 121, 9 0 5, 02, 2

2-ий 65, 72, 5 38, 3 15, 3 – 116, 1 0 16, 03, 7

 

При визначенні активності літичних ферментів 1-го та 2-го варіантів відносно різних тест-культур нами було встановлено схожий спектр їх дії, тоді як активність 2-го типу було знижено в різній мірі, особливо відносно різних видів та штамів спорових бактерій. Отримані дані дозволили припустити, що у варіантів 2-го типу не тільки знижено літичну активність, а зміни можуть стосуватися складу їх ферментних комплексів.

Ацетонові препарати, виділенні з культуральної рідини 1-го та 2-го морфологічних варіантів, було досліджено з використанням методу іонообмінної хроматографії на КМ-сефадексі С-50. Встановлено, що варіант 1-го типу синтезує такий же комплекс стафілолітичних ферментів, як і батьківський штам 2435: на хроматограмі нами виявлено дві глікозидази, які не мають зв’язку з протеолітичною активністю, та в зоні градієнтної елюції білків – п’ять піків стафілолітичної активності, що відповідає розміщенню п'яти ендопептидаз, описаних раніше Соколовою (1985). В препараті 2-го морфологічного типу глікозидази відсутні, серед білків, які не сорбуються на катіонообміннику, виявлено ферменти з низькою стафілолітичною