Мінливість продуцента літичних ферментів Streptomyces recifensis var. Lyticus та його селекція

Враховуючи, що штам 1Р-92 було відібрано значно раніше, ніж штам 1Р-232, подальшу селекцію вели в першій лінії. На другому ступені використання рифампіцину також відбирали найбільш перспективні колонії по розміру зон деградації субстрату. Із 21 варіантів літична активність у шести з них перевищувала активність штаму 1Р-92 на 20-50%. Активність селекціонованого в цій лінії штаму 2Р-15 відносно клітин S. aureus та M. lysodeikticus зросла в 2, 5 та 5 разів порівняно з батьківським штамом. Встановлено, що висока активність штаму 2Р-15 обумовлена збільшенням показника середньої літичної активності природних варіантів (від 86, 41, 8 у вихідного штаму до 118, 21, 4%), значним накопиченням в популяції плюс-варіантів – 45, 44, 3 проти 2, 41, 7% в контролі (рис. 2). Крім того, в його популяції значно зросла кількість антибіотикостійких спор та знизилась частка варіантів 2-го морфологічного типу (з 7, 0 до 1, 5%).

Отримані результати свідчать не тільки про принципову можливість використання рифампіцину в селекції продуцентів екстрацелюлярних ферментів, а й про високу його ефективність.

Виходячи з того, що для забезпечення високого рівня біосинтетичної активності любого нового штаму важливе значення має збалансованість живильних речовин, нами було прове дено оптимізацію вихідного ферментаційного середовища. Оптимізацію проводили на основі методу математичного планування експерименту, який дозволяє випробувати всі компоненти середовища на декількох рівнях (Горський, Бродський, 1965). Оптимізацію проводили в два етапи: спочатку по основним джерелам живлення (С, N. P), а потім по мікро- та макроелементному складу. Вплив різних компонентів та їх концентрацій визначали по рівню стафілолітичної активності.

Вже на першому етапі на п’яти варіантах середовища (4+1) при вирощуванні двох рифампіциностійких мутантів (1Р-40 та 1Р-116) їх стафілолітична активність зросла в 4, 6-9 разів (табл. 4 – дані наведено для одного штаму). В подальших дослідженнях, згідно методу симплекса, оптимізацію проводили шляхом заміни найгіршого варіанту новим складом. Нам необхідно було провести лише одну ступінь оптимізації, щоб досягти максимальної активності досліджуємих штамів.

 

Таблиця 4

Вплив зміни концентрацій основних джерел живлення (N, C, Р) у вихідному ферментаційному середовищі (ФС-1) на стафілолітичну активність рифампіциностійкого мутанту

 

Штам Номер

варіанту середовища Літична активність од/мл Коефіцієнт різниці Ступінь оптимізації Літична активність од/мл Коефіцієнт різниці

 

 

 

1 Р-40 1 208042, 0 7, 4 - - -

2 180057, 7 6, 4 - - -

3 173076, 8 6, 1 III 2210103, 0 7, 8

4 130028, 9 4, 6 I 315086, 6 11, 1

5 142095, 3 5, 0 II 135028, 9 4, 8

ФС-1 (К) 28028, 9 1, 0 ФС-1 (К) 28028, 9 1, 0

 

На другому етапі, при оптимізації отриманого варіанту середовища по вмісту мікро- та макроелементів, встановлено, що зміна їх концентрацій, порівняно з основними джерелами живлення (C, N, P), впливає значно менше. Застосування симплексного методу дозволило нам при мінімальних затратах (на двох ступенях було досліджено всього 13 варіантів середовища) оптимізувати співвідношення десяти компонентів. Новий варіант ферментаційного середовища (ФС-2) використовували при оцінці літичної активності відібраних мутантів. На цьому середовищі їх активність досягала 2500 – 6300 од/мл.

Аналогічним чином було отримано ще один варіант середовища (ФС-3) для селекціонованого штаму 2Р-15. Нові варіанти відрізняються від вихідного середовища перш за все значним (в 10 та 15 разів) підвищенням вмісту глюкози та деяким збільшенням концентрації ряду інших компонентів.

Як відомо, селекція високоактивного штаму невід'ємно пов'язана з проблемою збереження цієї ознаки в процесі культивування. Згідно нових підходів в рішенні цієї задачі можуть бути використані антимутагени, регулятори експресії процесів метаболізму та деякі антибіотики при введенні їх в агаризоване середовище (Даніленко, Родіонова, 1988).

З метою збереження високої активності відібраних рифампіциностійких мутантів нами було опробувано введення рифампіцину в різних концентраціях в агаризоване середовище вирощування двох штамів – 1Р-92 та 1Р-232. Їх культури послідовно пересівали на середовище Гаузе 1 без антибіотика та з зростаючими його концентраціями від 5 мкг/мл до 12, 5 мкг/мл. Стафілолітичну активність субкультур в різних лініях визначали в од/мл та виражали в відсотках від активності вихідних культур. Встановлено, що концентрації антибіотика від 7, 5 до 12, 5 мкг/мл стабілізують активність, а у ряда субкультур – навіть збільшують її на 15 – 25%.

В другій серії досліджень використано природний варіант штаму 1Р-92 (ПВ-12). Було отримано по 7 субкультур в чотирьох лініях. В кожній лінії використовували одну концентрацію антибіотика: 5, 0; 7, 5 та 10 мкг/мл, контрольна лінія – без антибіотика. Встановлено, що в контрольній лінії уже у 3-ї субкультури літична активність знижується, а у 7-ї – вона складає 56, 1% від вихідної. Позитивні результати було отримано при введенні в середовище вирощування антибіотика в концентрації 7, 5 мкг/мл. В цій лінії у перших 4-х субкультур не тільки стабілізується, а навіть підвищується (на 7, 3-20, 7%) літична активність. Концентрація 10 мкг/мл для досліджуємого варіанту токсична