Портал освітньо-інформаційних послуг «Студентська консультація»

  
Телефон +3 8(066) 185-39-18
Телефон +3 8(093) 202-63-01
 (093) 202-63-01
 studscon@gmail.com
 facebook.com/studcons

<script>

  (function(i,s,o,g,r,a,m){i['GoogleAnalyticsObject']=r;i[r]=i[r]||function(){

  (i[r].q=i[r].q||[]).push(arguments)},i[r].l=1*new Date();a=s.createElement(o),

  m=s.getElementsByTagName(o)[0];a.async=1;a.src=g;m.parentNode.insertBefore(a,m)

  })(window,document,'script','//www.google-analytics.com/analytics.js','ga');

 

  ga('create', 'UA-53007750-1', 'auto');

  ga('send', 'pageview');

 

</script>

Мінливість продуцента літичних ферментів Streptomyces recifensis var. Lyticus та його селекція

Предмет: 
Тип роботи: 
Автореферат
К-сть сторінок: 
30
Мова: 
Українська
Оцінка: 

досліджень відповідають основному плану науково-дослідних робіт НДІ біології та кафедри мікробіології та вірусології ДНУ. Робота виконана згідно держбюджетних тем № 64-94 “Дослідження регуляції біосинтезу літичних ферментів, нового лізоензимного препарату та сфери можливого його застосування” та № 01-11-97 “Дослідження особливостей метаболічних процесів у мікроорганізмів та розробка технічних умов виробництва нових біологічно активних препаратів”, які координуються планами науково-дослідних тем Міністерства освіти України.

Особистий внесок здобувача. Особиста участь дисертанта полягала у визначенні методичних підходів та проведенні експериментальних досліджень, статистичній обробці даних, узагальненні одержаних результатів та в співставленні їх з літературними матеріалами. Дослідження складу ферментного комплексу основних морфологічних варіантів батьківського штаму та селекціонованого – 2Р-15 здійснено за участю к. б. н. Соколової І. Є. (ДНУ, кафедра мікробіології та вірусології). Оптимізацію ферментаційного середовища на основі методу математичного планування експерименту було проведено за консультативною допомогою к. б. н. Кілочок Т. П. (НДІ біології ДНУ).
Апробація роботи. Матеріали дисертаційної роботи були представлені на з’їздах Українського мікробіологічного (Київ, 1994; Чернігів, 2000) та біохімічного товариства (Київ, 1994; 1997), на конференціях молодих вчених (Москва, 1989), на Міжнародних конференціях «Мікроорганізми та їх метаболіти в народному господарстві» (Кишинів, 1996), «Наука та освіта» (Дніпропетровськ, 1998), «Alliance Francaise» (Дніпропетровськ, 1998).
Публікації. Основні результати дисертації опубліковано у 8 роботах, в тому числі в 4-х журнальних статтях.
Структура та об'єм дисертації. Робота складається з вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, трьох розділів результатів власних досліджень, заключення, висновків та списку цитованої літератури, який включає 240 найменувань, з яких 92 іноземних. Роботу викладено на 150 сторінках машинописного тексту, ілюстровано 19 рисунками та 22 таблицями.
 
Основний зміст роботи
 
Огляд літератури
Огляд літератури складається з двох розділів, які висвітлюють принципи традиційних методів селекції продуцентів біологічно активних речовин, в основі яких лежить індукований мутагенез та ступінчатий відбір більш активних мутантів, а також розвиток нових напрямків в селекції – використання протопластів та отримання рекомбінантних штамів на основі їх злиття.
Критично розглянуті пошуки шляхів підвищення ефективності селекції продуцентів антибіотиків, амінокислот, ферментів. Значну увагу приділено використанню при селекції продуцентів ферментів модифікованого методу відбору найбільш активних мутантів та розробці селективних методів, які дозволяють вести спрямований відбір мутантів зі зміненими механізмами регуляції.
На основі аналізу літератури, при селекції продуцента літичних ферментів S. recifensis var. lyticus були використані протопластування та селективний відбір регуляторних мутантів за допомогою рифампіцину. Перспективні клони виявляли на індикаторному середовищі по розміру зон деградації субстрату. Вибрані методи та прийоми дозволили значно скоротити обсяг досліджень.
Матеріали та методи досліджень
Об'єктами досліджень були штами S. recifensis var. lyticus 2435 (Шинкаренко, 1979), П-29 (Кулікова та ін., 1994), рифампіциностійкі варіанти, відібрані в процесі роботи. Спорові культури вирощували при 28 оС на протязі 10 – 12 діб на агаризованому середовищі Гаузе 1.
Ростові показники та літичну активність різних культур визначали при глибинному вирощуванні (220 об/хв) при 28 оС: батьківського штаму 2435 – на раніше розробленому середовищі (Кілочок, 1988), штамів П-29, рифампіциностійких мутантів та селекціонованого штаму 2Р-15 – на двох нових варіантах середовища того ж складу, додатково оптимізованих нами на основі симплексного методу математичного планування експерименту (Горський, Бродський, 1965). Проби культуральної рідини відбирали в динаміці росту, або через 72 години. Про активність досліджуємих штамів судили по рівню бактеріолітичної активності.
При дослідженні впливу глюкози на біосинтез літичних ферментів стерильні її розчини вносили перед висівом штамів П-29 та 2Р-15 в ферментаційне середовище (ФС-2) до кінцевої концентрації від 1 до 5%. Зміну літичних активностей досліджуємих культур відносно клітин S. aureus та M. lysodeikticus виражали у відсотках від контролю (%).
Літичну активність визначали турбодиметричним методом (Isono et al., 1972). Реакційну суміш, яка містить 1 мл ферментного розчину та 1 мл клітин тест-культури (вихідна оптична щільність при  590 нм в 0, 5 см кварцевій кюветі складала 0, 5 – 0, 6) інкубували при 55 оС на протязі 30 хвилин. За одиницю активності приймали таку кількість ферменту, яка знижувала оптичну щільність суспензії на 0, 001 за 1 хвилину при розчині ферменту здатному сприяти лізису клітин на 25 – 30%. В якості субстрату (тест-культури) бактеріолітичних ферментів використовували відмиті клітини S. aureus та M. lysodeikticus. Питому активність виражали в од/мг білка.
Протеолітичну активність визначали методом Ансона в модифікації Авіженіса та Савіцкайте (1969), використовуючи в якості субстрату казеїн.
При виділенні ферментних комплексів з метою дослідження компонентного складу, супернатант охолодженої культуральної рідини змішували з охолодженим ацетоном в об’ємному співвідношенні 1: 1, 5. Створений осад за 1, 5 години відділяли на рефрижераторній центрифузі при 3, 5 тис. об/хв при температурі – 20 оС. Осад суспензували в невеликому об'ємі 0, 02 М Na-ацетатного буферу (рН – 5, 6). Іонообмінну хроматографію ацетонових препаратів штамів 2435 та 2Р-15 проводили на КМ-сефадексі С-50 (Pharmacia, Швеція). На колонку (1, 2 х 35 см), заповнену іонообмінником та урівноважену 0, 02 М ацетатним буфером, наносили 1-3 мл (20-50 мг білка) розчинів досліджуємих препаратів. Елюцію білків з колонки проводили спочатку ацетатним буфером з вихідною молярністю, а потім з зростаючою молярністю від 0, 02 до 1 М. Профіль
Фото Капча