Мінливість продуцента літичних ферментів Streptomyces recifensis var. Lyticus та його селекція

 

Жерносєкова І. В. Мінливість продуцента літичних ферментів Streptomyces recifensis var. lyticus та його селекція – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03. 00. 07 – мікробіологія. – Інститут мікробіології та вірусології НАН України, Київ, 2002.

Дисертацію присвячено дослідженню мінливості продуцента літичних ферментів та підвищенню його активності на основі відбору рифампіциностійких мутантів. Попереднє визначення активності по зонам деградації субстрату надало можливість скоротити кількість відбираємих варіантів. У більшості з них в умовах глибинної ферментації літична активність перевищувала вихідні штами на 20 – 150%. На основі використання регенеранта П-29 та рифампіцину на двох ступенях селекції відібрано штам 2Р-15, літична активність якого досягла відносно S. aureus 5800 – 6300 од/мл та M. lysodeikticus – 8000 – 9000 од/мл, що перевищує активність батьківського штаму відповідно в 2, 5 та 5 разів. Показано принципову можливість використання рифампіцину для стабілізації активності відібраних мутантів шляхом внесення його в оптимальних концентраціях в агаризоване середовище вирощування.

У мутантного штаму 2Р-15 чутливість до інгибуючої дії глюкози значно знижено, він потребує збільшення вмісту глюкози в середовищі. В складі бактеріолітичного комплексу виявлено кількісні та якісні зміни: в пулі екстрацелюлярних білків зросла частка літичних протеаз, їх кількість та питома активність. Високоактивний штам 2Р-15 являється перспективним для виготовлення нового препарату літичних ферментів.

Ключові слова: стрептоміцет, літичні ферменти, ступінчата селекція, рифампіцин, мутантний штам 2Р-15.

 

Жерносекова И. В. Изменчивость продуцента литических ферментов Streptomyces recifensis var. lyticus и его селекция – Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03. 00. 07 – микробиология. – Институт микробиологии и вирусологии НАН Украины, Киев, 2002.

Диссертация посвящена изучению S. recifensis var. lyticus, продуцента комплекса литических ферментов. Результаты исследований показали, что его активность зависит от содержания в популяции вариантов (1-го) морфологического типа.

Проведена селекция родительского штамма 2435 с использованием отбора регуляторных мутантов с помощью рифампицина. Исходный штамм П-29, отобранный ранее из числа наиболее активных регенерантов, при лабораторном культивировании выявил нестабильность. Снижение его активности было связано как с накоплением в популяции неактивных вариантов (11, 9%), так и с изменениями генома, на что указывает увеличение потребности в глюкозе, а также снижение чувствительности синтеза стафилолизинов к репрессирующему действию возрастающих ее концентраций. На всех этапах селекции предварительно определяли литическую активность естественных вариантов и рифампициноустойчивых мутантов исходных штаммов (П-29, 1Р-92 и 1Р-232) по величине зон лизиса убитых клеток S. aureus, внесенных в верхний слой индикаторной среды. На двух ступенях применения возрастающих концентраций антибиотика (от 6 до 20 мкг/мл) из сотен проверенных клонов было отобрано 51 вариант. У большинства из них в условиях глубинной ферментации литическая активность превышала исходный штамм П-29 на 20 – 150%. Установлено, что частота возникновения плюс-вариантов среди рифампициноустойчивых мутантов зависит от выбора исходного штамма и концентрации антибиотика, внесенного в среду.

В результате трехступенчатой селекции с использованием регенеранта (П-29) и двух ступеней отбора рифампициноустойчивых мутантов получен штамм 2Р-15, литическая активность которого в отношении клеток S. aureus достигла уровня 5800 – 6300 ед/мл, M. lysodeikticus – 8000 – 9000 ед/мл, что превысило активность родительского штамма 2435 соответственно в 2, 5 и 5 раз.

Для реализации высокой активности рифампициноустойчивых мутантов и штамма 2Р-15 на основе метода математического планирования эксперимента (метод симплекса) проведена оптимизация ферментационной среды вначале по количественному содержанию основных источников питания (соевая мука, NH4NO3, глюкоза, K2HPO4), а затем – по микро- и макроэлементному составу. Получено два новых варианта среды, отличающихся от исходной 10-ти и 15-ти кратным повышением содержания глюкозы и некоторыми изменениями концентраций ряда других компонентов.

Установлено, что чувствительность к ингибирующему действию глюкозы у штамма 2Р-15 по сравнению с родительским штаммом снижена в 3-4 раза.

Впервые показана принципиальная возможность применения рифампицина для стабилизации активности рифампициноустойчивых мутантов при внесении его в определенных концентрациях в агаризованные среды культивирования. Оптимальная концентрация рифампицина, обеспечивающая стабилизацию штамма 2Р-15 при последовательных пересевах и длительном хранении – 10 мкг/мл.

Высокая активность штамма 2Р-15 связана с увеличением показателя средней литической активности клонов (с 82, 32, 4% до 118, 21, 4%), значительным накоплением в популяции плюс-вариантов (до 45, 44, 3%), снижением коэффициента вариации. В популяции штамма 2Р-15 возросло также содержание рифампициноустойчивых спор, снижено число вариантов 2-го морфологического типа (с 7% до 1, 5%).

Штамм 2Р-15 сохранил способность синтезировать бактериолитический комплекс, обладающий широким спектром действия, но утратил дрожжелитическую активность. По данным ионообменной хроматографии, проведенной на КМ-сефадексе С-50, в составе бактериолитического комплекса штамма 2Р-15 произошли как количественные, так и качественные изменения: в пуле его экстрацеллюлярных белков возросла доля (с 10% до 23, 7%) и число литических протеаз (от 5 у родительского штамма до 11), а также их удельная активность.

На основании полученных результатов можно заключить, что применение рифампицина для отбора регуляторных мутантов и чашечного метода для предварительной оценки литической активности разных клонов способствовало значительному снижению трудоемкости селекции и повышению ее эффективности. Отобранный высокоактивный мутант 2Р-15 является перспективным в плане создания на его основе производства нового ферментного препарата, отличающегося широким спектром литического действия, а также ростстимулирующими и иммунотропными свойствами.

Ключевые слова: стрептомицет, литические ферменты, ступенчатая селекция, рифампицин, мутантный штамм 2Р-15.

 

Zhernosekova I. V. Changeability of the producer of lytic enzymes Streptomyces recifensis var. lyticus and its selection. – Manuscript.

The dissertation for the bachelor`s degree competition for speciality 03. 00. 07 – microbiology. The institute of microbiology and virology NAS Ukraine, Kiev, 2002.

The dissertation is devoted to the research of changeability of the producer of lytic enzymes and to elevation of its activity on the base of use selection of rifampycin-resistant mutants. Previous activity determination according to zones of substrate degradation gives a possibility to shorten the quantity of selected variants. The mazority of the variants shows the elevation of activity comparing the initial strains for 20 – 150% under the conditions of deep fermentation. On the base of use of regenerant P-29 and rifampycin at two steps of selection the strain have been selected 2P-15, its lytic activity reached 5800 – 6300 Un/ml comparing with S. aureus and M. lysodeikticus – 8000 – 9000 Un/ml. The elevation of activity comparing with initial strain was in 2, 5 and 5 times correspondingly. It was shown the principle possibility of rifampycin using for stabilization of activity of selected mutants by its bringing in medium in optimal concentrations.

The sensivity to catabolic repression at mutant strain 2P-15 is decreased. This strain needs the evaluation of glucose concentration in medium.

The quantitative and qualitive changes have been revealed in bacteriolytic complex: there was an elevated part of lytic proteinases in extracellular pool, their number and specific activity were also increased. Highly-active strain 2P-15 is very perspective for industrial making of new preparations.

Key words: streptomycet, lytic enzymes, stepped selection, rifampycin, mutant strain 2P-15.