+3 8(066) 185-39-18
fПредмет:
Тип роботи:
Інше
К-сть сторінок:
120
Мова:
Українська
(дослідна). Суміші швидко перемішують і витримують в термостаті протягом 10 хв.
Потім із кожної пробірки почергово відбирають по 0,5 см3 розчину і переносять в колби з попередньо налитими 50 см3 робочого розчину йоду. Вміст перемішують.
Отримані розчини набувають наступне забарвлення:
Контрольний розчин – синій колір, дослідний – фіолетовий різної інтенсивності в залежності від кількості непрогідролізованого крохмалю.
Через 5-10 хв. після змішування визначають оптичну густину розчинів фотоелектричним колориметром в діапазоні довжини хвиль 630-670 нм в кюветах з товщиною поглинаючого світло шару 10 мм.
Контрольним розчином під час роботи на ФЕК є дистильована вода.
Обробляння результатів
Масу прогідролізованого крохмалю (m) в г визначають за формулою:
де Д1 – оптична густина контрольного розчину;
Д2 – оптична густина дослідного розчину;
0,1 – маса крохмалю, яка взята для аналізу, г.
Якщо маса прогідролізованого крохмалю менше 0,02 г або більше 0,06г, то аналіз повторюють, підбираючи інше розведення.
Амілолітичну активність (АС) в од./г для препаратів бактеріального походження і в од./см3 для культуральної рідини розраховують за формулою:
Амілолітична активність (АС1) в од./г для препаратів грибного походження розраховують за формулою:
де m1 – маса ферментного препарату, який міститься в 5 см3 робочого розчину, мг;
5,885; 0,001671; 7,264; 0,03766 – коефіцієнт розрахункового рівняння, які отримані при математичній обробці експериментальних даних залежності маси прогідролізованого крохмалю від маси ферменту, взятого для аналізу в перерахунку на 1 годину дії ферменту.
За остаточний результат аналізу приймають середньоарифметичне значення результатів Визначання активностей, що отримані при аналізі двох паралельних наважок препарату, відносно допустиме розходження між якими не повинно перевищувати 5 %. Результат закруглять до першого десяткового знаку.
Межа можливих значень відносної похибки вимірювань при довірчій імовірності р = 0,95 складає 5 %.
Визначання глюкоамілазної активності
Сутність методу полягає у визначенні глюкози, що утворюється при гідролізі розчинного крохмалю ферментом глюкоамілази.
Глюкоамілазна активність (ГлС) характеризує здатність ферментного препарату каталізувати розщеплення розчинного крохмалю до глюкози і виражається числом одиниць активності в 1 г препарату.
За одиницю глюкоамілазної активності прийнято здатність ферменту каталізувати гідроліз розчинного крохмалю за визначених умов температури і рН, звільняючи за 1 хв. 1 мкмоль глюкози.
Прилади та реактиви
-Апаратура і матеріали – за п.1 із наступними доповненнями.
-Колориметр фотоелектричний лабораторний (фотоелектроколориметр) за ГОСТ 12083 або спектрофотометр.
-Калій фосфорнокислий однозаміщений за ГОСТ 4198, розчин молярної концентрації 1 моль/дм3.
-Калій залізистосинеродистий за ГОСТ 4207.
-Глюкоза за ГОСТ 6038.
-Натрій оцтовокислий за ГОСТ 199.
-Кислота оцтова за ГОСТ 61.
-Крохмаль розчинний за ГОСТ 10163.
-Кислота бензойна за ГОСТ 10521.
-Калій гідроксид за ГОСТ 24363, розчин молярної концентрації 1моль/дм3.
-Калій хлористий.
-Спирт етиловий ректифікований за ДСТУ 4221-2003.
-Глюкозооксидаза з ферментативною активністю 100000 од./г.
-Пероксидаза.
-Вода дистильована за ГОСТ 6709.
Підготовка до визначання
Приготування розчину крохмалю з масовою часткою
1 % (субстрату) – за п.1
Приготування фосфатного буферного розчину з рН 7,5
концентрацією 1 моль/дм3
Змішують рівні об’єми розчинів фосфорнокислого однозаміщеного калію і гідроксиду калію концентрацією 1 моль/дм3.
Величину рН перевіряють на приладі.
Приготування розчину залізистосинеродистого калію з масовою часткою 1 % (розчина А)
0,05 г залізистосинеродистого калію кількісно переносять в мірну колбу місткістю 50 см3 і об’єм доводять дистильованою водою до мітки.
Розчин готують безпосередньо перед Визначанням.
Приготування розчину глюкооксидази (розчина Б)
5,00 (6,00) мг глюкооксидази розчиняють фосфатним буферним розчином з рН 7,5 в мірній колбі місткістю 50 см3 і потім додають 2,0 мг пероксидази. Об’єм доводять до мітки фосфатним буферним розчином.
Якщо активність глюкооксидази відрізняється від необхідної
(100000 од./г), то наважку беруть з таким розрахунком, щоб в 50 см3 розчину містилось 500-600 од. активності.
Приготування робочого розчину С
Робочий розчин С готують змішуванням рівних об’ємів розчинів А і Б.
Одержаний розчин зберігають в темній склянці в холодильнику протягом 2-3 діб.
Приготування насиченого розчину бензойної кислоти
2,7 г бензойної кислоти кількісно переносять в мірну колбу місткістю 1000 см3 і доводять до мітки дистильованою водою.
Приготування стандартних розчинів глюкози
Для приготування стандартних розчинів глюкози користуються перекристалізованою із спирту зневодненою глюкозою, яку зберігають в ексикаторі над хлористим кальцієм.
100,00 мг глюкози розчиняють в 100 см3 насиченого розчину бензойної кислоти. Із цього розчину відбирають почергово 5, 10 і 15 см3 в мірній колбі місткістю 100 см3 і доводять об’єм до мітки бензойної кислоти. Отримані розчини відповідають вмісту 50, 100 і 150 мкг глюкози в 1 см3.
Ці розчини використовують для побудови градуювального графіка.
Приготування основного і робочого розчинів очищених ферментних препаратів готують за п.1
Робочий розчин готують із основного розчину, розбавляючи його дистильованою водою в залежності від передбаченої активності препарату.