Технологія спирту

 Приготування основного і робочого розчинів із повітряно-сухої культури гриба

1,00-5,00 г дослідної повітряно-сухої культури гриба (в залежності від активності) попередньо розтертої в ступці, переносять в конічну колбу місткістю 250 см3, додають 100 см3 дистильованої води, суміш витримують при кімнатній температурі протягом 1 год, періодично перемішуючи, а потім фільтрують.

Основний розчин зберігають потягом доби при температурі від 2 до 6°С.

Робочий розчин готують із основного, розбавляючи його дистильованою водою в залежності від передбаченої активності.

 

 Приготування робочого розчину із культуральної рідини

Відфільтровану культуральну рідину розбавляють дистильованою водою в 1000 і більше разів в залежності від передбаченої активності.

 

Побудова градуювального графіка

В пробірки приливають по 1 см3 стандартних розчинів глюкози, додають по 3 см3 робочого розчину С. В контрольну пробу (контроль на реактив С) замість глюкози доливають 1 см3 дистильованої води. Залишають пробірки на 45 хв. при кімнатній температурі для розвитку забарвлення. Потім виміряють інтенсивність забарвлення розчину глюкози в діапазоні довжини хвиль 390-415 нм в кюветах з товщиною поглинаючого світло шару 10 мм проти контрольної проби з реактиву С.

За отриманими значеннями будують градуювальний графік, що має лінійну залежність.

Робоча зона градуювального графіка лежить в області 50-150 мкг.

Оптична густина розчину повинна бути близькою до значень 0,1±0,01; 0,2±0,01; 0,3±0,01.

Якщо оптична густина відрізняється від цих значень, то наважку глюкооксидази збільшують.

 

 Проведення визначання

Беруть дві паралельні наважки досліджуваного продукту і з кожної роблять не менше двох розведень. Кожне розведення досліджуваного розчину аналізують не менше двох разів.

В пробірку наливають 10 см3 розчину крохмалю (субстрату) і ставлять в термостат або водяну баню з температурою (30,0±0,2)°С на 5-10 хв. Потім доливають до вмісту пробірки 5 см3 розчину досліджуваного продукту і інкубують суміш на протязі 10 хв при тій же температурі.

Потім 1 см3 суміші переносять в другу пробірку, що знаходиться в киплячій бані, витримують протягом 2 хв (для інактивації ферменту) і охолоджують холодною водою. Потім до суміші додають 3 см3 розчину С, перемішують і залишають на 45 хв при кімнатній температурі.

Одночасно готують контрольну пробу. Для цього 5 см3 розчину досліджуваного продукту витримують в киплячій водяній бані протягом 

10 хв (для інактивації ферменту). Потім розчин охолоджують і додають 10 см3 розчину крохмалю.

Всі наступні операції з контрольними пробами проводять також, як і з дослідними.

Крім вказаної контрольної проби на інактивований фермент ставлять контрольну пробу на робочий розчин С. Для цього до 3 см3 розчину приливають 1 см3 дистильованої води.

Інтенсивність забарвлення визначають на фотоелектроколориметрі в діапазоні довжини хвиль 390-415 нм в кюветах з товщиною поглинаючого світло шару 10 мм.

Якщо контрольні проби на інактивований фермент мають забарвлення, то необхідно досліджуваний розчин проколориметрувати, взявши в якості розчину порівняння робочий розчин.

Значення оптичної густини повинно знаходитись в межах відповідних масі глюкози від 50 до 150 мкг.

 

Обробляння результатів

Глюкоамілазну активність (ГлС) в од./г обраховують за формулою:

 

де m – маса глюкози, що утворилась в 1 см3 гідролізату за рахунок дії ферменту, знайденого за калібровочним графіком, мкг;

m1 – маса ферменту, що міститься в 1 см3 гідролізата, взятого на визначання, г;

10 – термін гідролізу, хв.;

180 – молекулярна маса глюкози, г/мкмоль.

 

Визначання глюкоамілазної активності (ГлС) глюкооксидазним методом  (арбітражний метод)

Сутність методу полягає у визначенні глюкози, що утворюється при гідролізі мальтози ферментом глюкоамілазою.

Глюкоамілазна активність характеризує здатність ферментного препарату каталізувати гідроліз мальтози з утворенням глюкози і виражається числом одиниць в 1 г (або 1 см3) препарату.

За одиницю активності глюкоамілази приймається здатність фермента каталізувати за визначених значень температури і рН гідроліз 1 мкмоль мальтози до глюкози за 1 хв.

Прилади та реактиви

-Ваги лабораторні загального призначення згідно з ГОСТ 24104.

-Цукромір універсальний СУ-3, СУ-4, автоматичний СП або автоматичні поляриметри А1-ЕПо або А1-ЕПЛ.

-Прилад для вимірювання рН середовища в діапазоні 0-14 з похибкою вимірювання ±0,1 рН.

-Термостат або ультратермостат, який забезпечує температуру нагріву (50±2)°С.

-Термометри за ГОСТ  28498 діапазоном вимірювання 0–100°С і ціною поділки шкали не більше 0,1°С.

-Колби типу Кн місткістю від 100 до 1000 см3 за ГОСТ 25336.

-Колби мірні наливні 1-го або 2-го класу виконання місткістю 100, 200, 250 і 1000 см3 за ГОСТ 1770.

-Воронки типу В за ГОСТ 25336.

-Піпетки типу 2, 1-го і 2-го класу виконання місткістю від 1 до 25 см3 за ГОСТ 29227 або ГОСТ 29169.

-Пробірки П1-21-200, П1-16-150, П2-19-180, або П2-16-150 за ГОСТ 25336.

-Мальтоза перекристалізована для бактеріальних цілей за НД.

-Розчин буферний ацетатний з рН 4,7, приготовлений за ГОСТ 4919.2.

-Кислота соляна за ГОСТ 3118, розчин молярної концентрації                        

5 моль/дм3.

-Цинк сірчанокислий 7 – водневий за ГОСТ 4174.

-Калій залізистосинеродистий 3 – водний за ГОСТ 4207.