Дослідження властивостей генноінженерних білків – потенційних компонентів вакцин

 

 

 

 

Дипломна робота: 53 с., 1 табл., 9 рис., 57 джерел.

Метою дипломної роботи було вивчити умови продукування рекомбінантного Кор-білку вірусу гепатиту С трансформованими клітинами E. coli.

Об’єктом досліджень була здатність модифікованих штамів E. coli codon+, pRARE2, pRPTGRO, pRPTKJG до продукції Кор-білка, що є антигеном, придатним для створення вакцини проти гепатиту С.

Методи досліджень – бактеріологічні (трансформація), фізико-хімічні (електрофорез, афінна хроматографія), імунологічні (ІФА).

Одержані результати та їх новизна: встановлено, що найбільш ефективне очищення Кор-білка можливе з використанням афінної хроматографії на колонці з Ni-NTA-агарозою: максимум очищеного білка виходить у 3-й фракції з отриманих при елюції буфером В.

Отримані результати є науковою основою для розробки схеми отримання рекомбінатного Кор-білка для розробки вакцини проти вірусу гепатиту С.

Ключові слова: ВІРУС ГЕПАТИТУ С, КОР-БІЛОК, ТРАНСФОРМАЦІЯ, ОЧИЩЕННЯ, ВАКЦИНА.

 

 

The graduation research of 4 year student (Oles Honchar DNU, Department of Microbiology, Virology and Biotechnology) devoted to creation of producent of rec-Core-protein of Hepatitis C virus.

The aim of research was to study the conditions of production of Core-protein of Hepatitis C virus by transformed cells of E. coli.

Object of research was ability of modified strains of E. coli to product the Core-protein, that is an antigen, can use in creation of vaccine against Hepatitis C virus.

Methods of research: bacteriological (transformation), physics-chemical (electrophoresis, affine chromatography), immunological (ELISA).

Results of research: it was determine that most effective purification of Core-protein was possible by method of affine chromatography on Ni-NTA-agarose-column: maximal rate of purified protein came in 3rd fraction from got during the elution by B-buffer.

Results, that are got, can be use by medicals and microbiologists.

Key words: HEPATITIS C VIRUS, CORE-PROTEIN, TRANSFORMATION, PURIFICATION, VACCINE.

Pages 50, bibliogr. 52, tables 1, ill. 9.

 

 

Вступ 

Огляд літератури

1. Генно-інженерні вакцини

2. Характеристика вірусу гепатиту С 

2.1. Загальні відомості 

2.2. Кор-білок та ініші оболонкові білки ВГС 

2.3. Неструктурні білки 

3. Методи отримання генноінженерних продуктів ВГС 

3.1. Отримання відповідного фрагменту нуклеїнової кислоти 

3.2. Трансформація клітин E. coli плазмідними векторами 

Експериментальна частина

4. Матеріали та методи досліджень 

4.1. Характеристика об’єкту досліджень 

4.2. Приготування поживних середовищ 

4.3. Отримання компетентної культури E. coli штамів codon+,

pRARE2, pRPTGRO, pRPTKJG 

4.4. Трансформація компетентних клітин E. сoli codon+, pRARE2,

pRPTGRO, pRPTKJG плазмідою pET15b core та індукція експресії

цільового рекомбінантного Кор-білка 

4.5. Проведення електрофорезу 

4.6. Отримання біомаси модифікованих культур 

4.7. Отримання рекомбінантного Кор-білка 

5. Результати та їх обговорення 

5.1. Створення штамів та перевірка активності синтезу 

5.2. Результати очищення рекомбінантного Кор-білка ВГС 

5.3. Результати імуноферментного аналізу 

Висновки 

Перелік посилань

 

 

Проблема штучних вакцин у високому ступені актуальна навіть стосовно переможених інфекцій (віспи, поліомієліту, кору та деяких інших). Під словом «переможені» маються на увазі ті інфекції, проти яких створені високоефективні вакцини. Водночас, використовувані у повсякденній практиці вакцини, проти таких інфекцій – це малоконтрольована сверхкомплексна суміш з величезною кількістю баластних, у тому числі високотоксичних, забруднюючих компонентів з мікробних клітин, живильного середовища і клітин еукаріот, на яких вирощуються віруси.

Необхідними для формування імунітету є 1-2 антигенні детермінанти, а вводиться в організм сотня найскладніших комплексів. Звідси виникають важкі реакції, ускладнення, алергізація щеплених. Отже, сучасна генна інженерія стоїть перед проблемою оптимізації штучних вакцин, їх нешкідливості та створенні єдиного багатокомпонентного препарату.

Найвищого ступеня актуальності проблема штучних вакцин досягає в області створення ефективних препаратів проти ще непереможених інфекцій, серед яких однією з найбільш важливих вважається гепатит С.

Вакцина проти гепатиту С до теперішнього часу не створена. Одна з основних причин – недостатня вивченість захисних механізмів вродженого і адаптивного імунітету в ході взаємодії ВГС і імунної системи господаря. Складність розробки вакцини полягає у високій гетерогенності ВГС і здатності вірусу уникати імунної відповіді господаря.

Основним підходом до створення вакцин проти гепатиту С сьогодні є використання індивідуальних рекомбінантних білків, окремих пептидів або ділянок геному ВГС в складі ДНК-конструкцій [3].

Показано, що в перший місяць гострої фази гепатиту С, коли вміст антитіл незначний, тільки кількість кор-білка збільшується настільки ж швидко, як і вірусної РНК. Кількісний аналіз вмісту кор-білка не виявив відмінностей у майбутніх реконвалесцентів і хроніків. Після 6 місяців гострого гепатиту С швидкість накопичення РНК і кор-білка починає зменшуватись. Майже всі пацієнти, що одужали від гострого гепатиту С, мають довічно антикор-антитіла, ймовірно, через високу імуногенність цього білка, що робить його одним з найбільш перспективних компонентів для потенційної вакцини.

Метою дипломної роботи було вивчити умови продукування рекомбінантного Кор-білку вірусу гепатиту С трансформованими клітинами E. coli.

Відповідно до мети були поставлені наступні завдання:

• створити штам