Дослідження властивостей генноінженерних білків – потенційних компонентів вакцин

 

 

Кор-білок формує вірусний нуклеокапсид. Виявлено, що він може існувати як у повнорозмірній формі (відомій як р21 і містить 191 амінокислотний залишок), так і у вкороченій з С-кінця. Білки, що мають довжину не менш 174 амінокислотних залишків, локалізовані в цитоплазмі, а коротші виявляються в ядрі. Вважається, що укорочені форми білка відіграють важливу роль в гепатоканцерогенезі. Нещодавно показано, що кор-білок здатний модулювати внутрішньоклітинну дію β-лімфотоксина, взаємодіючи з цитоплазматичної частиною його рецептора [55]. Нуклеокапсидний білок впливає на деякі транскрипційні фактори, залучені в регуляцію запального процесу. Він також може викликати порушення клітинного метаболізму тригліцеридів [45, 53]. Нуклеокапсидний білок, ймовірно, відповідальний за тривалу імуносупресію. Він є одним з найбільш імуногенних білків вірусу. Зазвичай він індукує потужну Т- і В-клітинну відповідь [36, 42].

Оболонкові білки (Е1 і Е2) утворюють нековалентно зв'язаний гетеродимер. Обидва білки інтенсивно глікозовані, в Е1 виявлено 5-6 потенційних ділянок N-глікозилювання, в Е2 – 11 аналогічних ділянок [31]. Відмітна структурна особливість оболонкових білків – наявність ділянок з високою частотою заміни амінокислотних залишків, які називаються варіабельними і гіперваріабельними зонами [56]. У Е2 знаходяться дві найбільш мінливі області вірусного поліпептида: HVR1 (27 амінокислотних залишків) і HVR2 (7 амінокислотних залишків), які локалізовані в N-кінцевій частині Е2. Е2 білок може існувати в двох формах: звичайній і подовженою, що містить маленький пептид, відомий як p7, на С-кінці [33]. Обидва оболонкових білка частково занурені в ліпідний бішар. Але більша частина їх поліпептидного ланцюга експонована на зовнішній поверхні бішару і володіє антигенністю. Ймовірно, оболонкові білки відповідальні за тропізм вірусу. Виявлено, що рекомбінантний Е2 білок взаємодіє in vitro з CD81, який, можливо, є рецептором для ВГC [42].

 

 

NS2-білок утворюється при аутокаталітичному розщепленні протеазою NS2/NS3. Активна область цієї протеази містить С-кінець NS2 і N-кінець NS3. Ніяких інших протеолітичних процесінгових функцій у цієї протеази, не знайдено.

NS3 білок володіє декількома каталітичними функціями. Протеазну активність має N-кінцевий домен [57]. Ця серинова протеаза бере участь в процессингу майже всіх вірусних неструктурних білків. У протеазному домені виявлена дуже слабка імуногенність. С-кінцевий домен білка NS3 володіє АТФазною / геліказною активністю, яка каталізує «кеп»-синтез у геномній РНК. Імунна відповідь на NS3 сфокусована в цьому домені [41].

Область NS4 містить 2 білки, які називаються NS4A і NS4B. Перший білок виконує роль кофактора серинової протеази. Передбачається, що другий білок бере участь в утворенні ВГC-реплікативного комплексу. В-епітопи в NS4A генотип-специфічні. У білку також знайдені Т-епітопи [41, 57].

Область NS5 складається з 2 білків – NS5A і NS5B. Білок NS5A інтенсивно фосфорильований. Ймовірно, він є компонентом реплікативного комплексу вірусу. У інфікованій клітині цей білок виявляється поряд з ядерною периплазматичною мембраною разом з білком NS5B. Як відомо, NS5B функціонує як РНК-залежна РНК-полімераза. Через відсутність 3'-5'-екзонуклеазної активності ця РНК-полімераза при реплікації робить багато помилок, що призводить до високої швидкості мутації. Обидва білка області NS5 імуногенні [40, 44, 57].

 

 

 

Фрагменти ДНК для вбудовування у вектор можна отримати безпосередньо з хромосомної ДНК, розщепивши її рестриктазами або зруйнувавши випадковим чином (наприклад, за допомогою ультразвуку) на сегменти з приблизно однаковою довжиною. Виділення генів за допомогою «вирізання» з генома, як правило, складається з чотирьох етапів:

1) отримання клонотеки фрагментів геному;

2) виявлення фрагментів геному, що містять необхідний ген, і точної локалізації гена в даному фрагменті;

3) вирізання гена з фрагмента (ів) за допомогою рестриктаз і зшивання ділянок гена за допомогою ДНК-лігази фага Т4, якщо ці ділянки отримані з різних фрагментів;

4) ампліфікація гена в складі векторної молекули.

Зазначений спосіб отримання генів є найбільш прийнятним для протозойних збудників, бактерій і для деяких складно влаштованих ДНК-вірусів. Такі операції проводяться, зокрема, при створенні так званих «бібліотек генів», тобто набору однакових векторних систем, в сукупності що несуть в собі весь геном даного організму [22]. Однак цей підхід має ряд істотних недоліків. По-перше, дуже складна задача підбору рестриктаз, що дозволяють вирізати з геномної ДНК або клонованого фрагмента геному цілісний ген. Як правило, разом з геном залишаються фланкуючі його зайві нуклеотидні послідовності, що заважає подальшому використанню цього гена, або ж рестріктази відрізають частину гена, роблячи його функціонально неповноцінним. По-друге, створення клонотеки генома збудника представляє спеціальну задачу і вимагає великих витрат часу. Нарешті, для ряду ДНК-вірусів (паповавіруси) доведений сплайсинг-залежний характер структури генів. Цілком зрозуміло, що виділені гени цих вірусів внаслідок наявності інтронних областей не будуть проявляти функціональної активності в бактеріальних клітинах і є непридатними при вирішенні задач з конструювання рекомбінантних противірусних вакцин. По-третє, якщо ген становить незначну частку від усієї геномної ДНК, то виникають великі труднощі з його ізоляцією й ідентифікацією [16].

Найбільш поширеним є шлях отримання генів через синтез ДНК-копій (кДНК) інформаційних або будь-яких інших (в оптимальному випадку – індивідуальних) РНК шляхом їх