Дослідження властивостей генноінженерних білків – потенційних компонентів вакцин

По 1 мл культури переносили до мікропробірок та інкубували на льоду протягом 10 хв після чого, відцентрифуговували на центрифузі при 5000 об/хв при 4°С протягом 5 хв і ретельно видаляли супернатант.

Клітини ресуспендували у 1 мл 0, 1 М CaCl2, інкубували на льоду протягом 30 хв. Потім клітини ще раз центрифугували при 5000 об/хв при 4°С протягом 5 хв та ретельно видаляли супернатант.

Клітини ресуспендували у 0, 2 мл. 0, 1 М CaCl2 та інкубували при 4°С протягом 60 хв.

 

 

Після розморозки плазміди pET15b core на льоду клітини кожного штаму E. coli розділяли по 100 мкл на 2 пробірки. До першої пробірки для кожного штаму додавали 5 мкл плазміди (дослід), до другої – нічого (контроль).

Далі інкубували суміш на льоду 40 хв, потім інкубували на водяній бані при 42 °С протягом 90 с. Після цього інкубували 2 хв на льоді [17].

До кожної мікропробірки (дослід та контроль) додавали по 400 мкл поживного середовища LB. Далі інкубували в термостаті при 37 °С протягом 1 год. Після здійснювали висів отриманих культур на агаризоване поживне середовище LB з 60 мкг/мл хлорамфеніколу, 100 мкг/мл ампіциліну та інкубували протягом ночі у термостаті при 37 °С[17].

У 4 пробірки, що містили середовище 2 YT, вносили колонії бактерій з чашок Петрі з агаризованим середовищем LB. Далі пробірки центрифугували та отримували матеріал у вигляді осаду, в якому містились клітини. Дану процедуру маркували як 0 год – без ІПТГ (Ізопропіл-β-D-1-тіогалактопіранозид – індуктор для експресії білка core ВГС в клітинах E. сoli). Таку процедуру проводили ще 3 рази з інтервалом у 1 годину з 45 мкл ІПТГ. Кожну наступну процедуру маркували як 1 год, 2 год, 3 год – з ІПТГ. Для оцінки ролі ІПТГ застосувували метод електрофорезу на наступному етапі та вимірювали оптичну густину кожну годину для побудування графіку залежності росту культури від часу культивування [6, 17].

 

 

Електрофорез проводили в поліакриламідному гелі, що містив лаурилсульфат натрію або SDS-PAGE. Для верхнього гелю:

2, 7 мл ddH2О;

0, 67 мл 30% суміші акриламіду;

0, 55 мл 1, 0 M Tris, pH 6. 8;

0, 1 мл 10% SDS;

0, 05 мл 10% амонію персульфату;

0, 06 мл TEMED.

Для нижнього гелю:

3, 0 мл ddH2О;

2, 5 мл 30% суміші акриламіду;

2, 8 мл 1, 5M Tris, pH 8. 8;

0, 1 мл 10% SDS;

0, 06 мл 10% амонію персульфат;

0, 07 мл TEMED.

Збирали пластинку, заливали «пробку» (1 мл) до низу пластинки, витримували 10 хв, фільтрувальним папером збирали воду. Потім, обережно, з боку пластинки вносили 5 мл нижнього гелю, додавали 20 мл дистильованої води зверху для вирівнювання гелю. Витримували 20 хв, сушили гель фільтрувальним папером [1, 4].

Встановлювали до пластинки гребінку (1 см) і заливали верхній гель, уникаючи бульбашок.

Готували камеру для проведення електрофорезу:

• приєднували пластинку з гелем до камери;
• готували 75 мл 1 хелатного буферу (15 мл хелатного буферу та 60 мл дистильованої води) ;
• заповнювали верхній резервуар свіжим буфером, а в нижній резервуар додавали старий буфер.

У пробірку «Епендорф» уміщували міоглобін (17, 8 кДа) і карбоангідразу (29 кДа) і додавали 0, 5 мл дистильованої води і 0, 5 мл буфера (sample buffer (900 мкл) і меркаптоетанол (100 мкл)). У 14 пробірок «Епендорф» вносили однакову кількість складу: 25 мкл буферу і 25 мкл осаду клітин досліджуваних штамів E. Сoli [1, 4].

Далі всі зразки з пробірок переносили в кишеньки гелю для внесення по 50 мкл та здійснювали електрофорез при кімнатній температурі. Умови: U = 100-200 V, I = 30-40 mA, час – 60-80 хв.

Виявлення і локалізацію білкових зон після їх поділу електрофорезом в ПААГ здійснювали шляхом їх фарбування у гелі. Для забарвлення гель вимочували в розчині барвника (Кумассі яскраво синій). Витримка дифузії – 24 год. Відмивання йде тільки за рахунок дифузії барвника з гелю, воно займало 3-4 дні. Візуалізація результатів індукції електрофорезом (при значенні напруги 120-140 В) виявила штами з високим рівнем експресії протеїну core ВГС [21].

 

 

Штами експресуючі протеїн core ВГС зберігали при -70 °С. З пробірок «Епендорф» відбирали суспензію клітин і поміщали в раніше підготовлені для кожного штаму 2 пробірки з рідким середовищем LB (5 мл). Дані пробірки поміщали в шейкер (New Brunswick Scientific Excella E24 Incubator) на швидкості RPM = 150 на 24 години при 37 °С. Після 24 год вміст обох пробірок діставали і додавали їх