Дослідження властивостей генноінженерних білків – потенційних компонентів вакцин

1) виділення високоочищених мРНК, що кодують структурні білки, або виділення геномних РНК вірусів;

2) синтез дволанцюгових ДНК (гени) на матрицях РНК;

3) ампліфікація гена за допомогою методів молекулярного клонування.

Як зазначалося, першим етапом в отриманні генів за допомогою методів зворотної транскрипції є виділення і очищення геномних РНК або мРНК. Геномні РНК виділяють головним чином з очищених віріонів, а мРНК – з інфікованих клітин. Для виділення мРНК з інфікованих клітин використовують різні способи. В одному з варіантів виділення мРНК з інфікованих клітин проводять безпосередньо із лізованих клітин (лізис здійснюють у денатуруючих середовищах з метою запобігання руйнівної дії нуклеаз на мРНК) з наступною екстракцією фенолом і хлороформом або центрифугуванням лізату через подушку 5, 7M СsCl (для звільнення від клітинних ДНК) і заключною афінною хроматографією на оліго (dТ) -целюлозі (полі (У) -сефарозі). Виділення мРНК можна проводити з очищених полірибосом інфікованих клітин [23].

У разі необхідності отримання специфічних мРНК, що кодують структурні білки збудника, використовують наступний спосіб: інфіковані вірусом клітини руйнують механічним шляхом або хімічними методами (використання неіонних детергентів). Клітинний лізат звільняють від ядер і мітохондрій методом диференціального центрифугування і піддають хроматографії на антитільному сорбенті. При цій процедурі з антитілами, специфічними до певного структурного білку збудника, зв'язуються полісоми, що здійснюють синтез цього білка. Також може бути використаний метод непрямої імунопреципітації полісом, при якому комплекс антитіло – полісома преципітується з розчину додаванням другого антитіла, специфічного до першого. В якості другого антитіла найчастіше беруть фіксовані формаліном клітини Staphylococcus aureus, на поверхні яких знаходиться так званий білок А, що має спорідненість до Fc-фрагментів Ig. З полісом, отриманих одним з описаних способів, далі вже виділяють мРНК [17, 23, 24].

Інший шлях виділення індивідуальних мРНК базується на властивості мРНК взаємодіяти з комплементарними ДНК, пов'язаними з твердим носієм (целюлоза, сефароза, нітроцелюлозні фільтри). Цей метод відбору та очистки специфічних мРНК є найефективнішим. Однак його застосування можливе лише при наявності відповідних комплементарних ДНК [22].

Отримання препарату очищеної мРНК дозволяє перейти до процедури синтезу гена за допомогою зворотньої транскрипції, яку здійснюють за допомогою ревертази AMV у спеціально підібраних умовах. У процесі зворотної транскрипції матрицею є мРНК, а затравкою оліго (dT12-18) (для мРНК, що мають полі (А) -хвіст) або хімічно синтезований олигонуклеотид, комплементарний 3'-кінцю мРНК. Після синтезу на мРНК комплементарного ланцюга ДНК і руйнування РНК (частіше використовується обробка лугом) здійснюють синтез другого ланцюга ДНК. У цій реакції матрицею є перший ланцюг ДНК. Реакція може каталізуватися як ревертазою, так і ДНК-полімеразою [22, 24].

Після отримання дволанцюгової кДНК наступна стадія отримання гена, що полягає в гідролізі одноланцюжкові ділянки ДНК, що з'єднує перший та другий ланцюги, нуклеазою S1 [23, 24].

Для отримання необхідних ділянок РНК використовують дві групи способів:

1) розщеплення полірибонуклеотидного ланцюга РНК в заданому місці;

2) синтез РНК (ферментативний на ДНК-або РНК-матрицях і хімічний).

Розщеплення полірибонуклеотидного ланцюга РНК може здійснюватися в присутності різних ферментів. Для цієї мети використовують ферменти: рибонуклеазу H, нуклеази, ковалентно пов'язані з олигонуклеотидами (наприклад, стафілококова нуклеаза), рибозими (наприклад, Рибозим L-19) [19, 16].

Історично першим способом спрямованої ферментативної фрагментації РНК (званої також адресованою, сайт-спрямованою або сайт-специфічною фрагментацією РНК) є метод гідролізу РНК ферментом РНКазою H в присутності комплементарних олігодезоксирибонуклеотидів. Цей метод досі залишається найбільш універсальним способом спрямованої фрагментації РНК[23].

Метод заснований на властивості РНКази Н розщеплювати полірибонуклеотидний ланцюг РНК у складі ДНК-РНК-гетеродуплекса. До ділянки РНК, за якою планується провести її фрагментацію, синтезується комплементарний олігодезоксирибонуклеотид довжиною в 6-10 нуклеотидних залишків. Далі отримують комплекс цього олигонуклеотида з РНК, який потім обробляють ферментом. У роботі зазвичай використовують РНКазу Н Escherichia coli – цілком доступний фермент, який може бути досить легко очищений від всіх супутніх нуклеазних домішок. Цей метод знайшов досить широке застосування для сайт-специфічного розщеплення вірусних і рибосомних РНК, а також для ідентифікації продуктів процесингу деяких РНК [16, 19, 24].

Важливою перевагою даного методу є і те, що в результаті гідролізу РНК рибонуклеазою Н утворюються фрагменти, у одного з яких на 5'-кінці міститься фосфатна група, а в іншого 3'-кінець вільний (нефосфорильований). Такі фрагменти можна прямо використовувати в реакції ферментативного лігування.

Серйозним обмеженням цього методу є те, що ділянка РНК, з якою зв'язується комплементарний йому олігодезоксирибонуклеотид, повинна мати однотяжеву конформацію і перебувати на поверхні макромолекули РНК, що представляє собою в умовах розщеплення компактну глобулу з розвиненою вторинною структурою. В окремих випадках це обмеження вдається подолати, використовуючи досить довгі олігодезоксирибонуклеотиди (15-20-членні), які попередньо відпалюють з частково або повністю денатурованої РНК.

Інше обмеження методу фрагментації полірибонуклеотидів РНКазою Н в присутності комплементарних олігодезоксирибонуклеотидів полягає в тому, що в загальному випадку передбачити, який з фосфодиефірних зв'язків в гетеродуплексі (або у безпосередній близькості від нього) піддасться розщепленню, не вдається. Більш того, фермент часто гідролізує не один, а кілька сусідніх міжнуклеотидних зв'язків. Ясно, що для подальшого конструювання рекомбінантних РНК такі фрагменти можуть виявитися непридатними [8, 16].

Розщеплення РНК може проводитися і за участю нуклеаз, ковалентно зв'язаних з олігонуклеотидами. Принцип цього методу полягає в тому, що