Дослідження властивостей генноінженерних білків – потенційних компонентів вакцин

Однак, як і у випадку РНКази Н, розщеплення РНК олігонуклеотид-нуклеазою часто проходить по декількох міжнуклеотидних зв'язках, що дещо обмежує можливості застосування цього методу для отримання рекомбінантних РНК.

Для розщеплення РНК застосовують також рибозими (природні РНК і синтетичні полірибонуклеотиди, здатні каталізувати цілий ряд перетворень у інших РНК). Перший рибозим у науковій літературі позначають як рибозим L-19. Цей рибозим є РНК довжиною у 395 нуклеотидних залишків, у 5'-кінцевій області якої є гексануклеотидна послідовність GGAGGG, відповідна за специфічність розщеплення попередника 26S РНК при самосплайсингу. Ця послідовність комплементарна CUCUCU послідовності, розташованій на 3'-кінці першої екзонної ділянки попередника 26S РНК. Якщо цю РНК замінити іншою, але такою, що обов'язково містить доступну для комплементарного зв'язування CUCUCUA послідовність, то Рибозим L-19 у присутності гуанозина або гуанілових нуклеотидів з вільною 3'-гідроксильної групою розщепить її [8, 23, 24].

Джерелом необхідних ділянок РНК може служити такий спосіб, як синтез фрагментів РНК. Ферментативний синтез сегментів РНК здійснюють з використанням різноманітних генно-інженерних конструкцій. Однак сьогодні у переважній більшості випадків для препаративного отримання РНК використовуються РНК-полімерази, закодовані в геномах ряду ДНК-вмісних бактеріофагів (Т3, Т7 і SP6). Вони характеризуються дуже високою активністю і, на відміну від клітинних РНК-полімераз, складаються з одного поліпептидного ланцюга. Важливо також те, що ініціація і термінація синтезу РНК цими полімеразами відбувається на одному певному нуклеотидному залишку.

Отримані одним із способів фрагменти нуклеїнових кислот в подальшому вбудовують у векторні молекули [23, 26].

 

 

Процес проникнення плазмідної ДНК в бактеріальну клітину з наступною модифікацією її генома називається трансформацією. У природних умовах бактеріальні клітини практично не здатні до поглинання ДНК. Це пов'язано, перш за все, з міцною клітинною стінкою, що складається з пептидоглікану, яку, наприклад, має клітина E. coli, а також з негативним зарядом її зовнішньої мембрани, до складу якої входять фосфоліпіди і ліпополісахариди. Оскільки молекула ДНК також заряджена негативно, то її проникнення в бактеріальну клітину стає проблематичним з механічних та електростатичних причин. Для вирішення цієї проблеми було розроблено три методи трансформації: хімічна трансформація, електропорація і трансформація за допомогою мінералів [17].

У першому випадку для того, щоб проникнення ДНК в клітину стало можливим, необхідно підготувати бактеріальні клітини до поглинання ДНК, тобто зробити їх компетентними. Для цього клітини E. coli обробляють розчином бівалентних катіонів (Ca2+, Mg2+, Rb+, Mn2+) при низьких температурах. Це призводить з одного боку до зниження загального негативного заряду поверхні бактеріальної клітини E. coli, а з іншого боку змінює рухливість фосфоліпідного бішару (він стає менш рухливим). Деякі протоколи приготування компетентних клітин включають в себе обробку клітин такими речовинами, як PEG і DMSO. Було показано, що у присутності цих речовин трансформація проходить набагато ефективніше. Можливо, це пов'язано з тим, що додавання цих речовин збільшує загальну в'язкість розчину і стерично полегшує взаємодію клітин і ДНК. Крім цього, ці речовини є кріопротекторами, тобто забезпечують зберігання готових препаратів компетентних клітин при низьких температурах [6, 7].

Сама процедура хімічної трансформації складається з трьох основних стадій. На початку компетентні клітини інкубують на льоду з ДНК. На цій стадії ДНК «прилипає» до бактеріальної клітинної стінки, завдяки взаємодії з бівалентними катіонами, які виступають сполучною ланкою між клітиною і ДНК [15, 17].

Друга стадія полягає в дуже короткому (від 30-40c або до хвилини) тепловому шоці при 42 °С. На цій стадії через різке підвищення температури плинність фосфоліпідного бішару різко збільшується, в мембранах бактеріальних клітин виникають несанкціоновані пори, через які ДНК проникає в клітину. Дуже важливо після проведення теплового шоку відразу охолодити суміш клітин з ДНК на льоду, оскільки при температурах 40- 42 °С клітини E. coli гинуть [17].

На третій стадії до суміші клітин з ДНК додають живильне середовище без антибіотиків (LB або SOC) і ростять при перемішуванні за температури 37 °С. На цій стадії відбувається відновлення трансформованих клітин і їх розмноження. Після цього суспензію клітин висівають на чашку з твердим живильним середовищем, що містить необхідний антибіотик. Метод хімічної трансформації зазвичай використовують, коли працюють з плазмідами розміром 2-10 kb [6].

У разі електропорації проникнення ДНК в бактеріальну клітину відбувається під дією електричного поля при високій напрузі протягом короткого часу. Умови електропорації (напруженість поля і тривалість імпульсу) можуть вимагати попередньої оптимізації. Підготовка клітин не вимагає обробки їх іонами двовалентних металів, але необхідно кілька разів промити їх стерильним розчином 10% гліцерину від солей, що містяться у поживних середовищах, так як наявність навіть їх мінімальних концентрацій може різко збільшити провідність при електропорації і знизити загальну ефективність трансформації. Електропорацію проводять у спеціальних кюветах електропораторів. У кюветі змішують електрокомпетентні клітини і ДНК, потім кювету поміщають в електропоратор і проводять електропорацію. Потім до суміші клітин і ДНК додають живильне середовище, дорощують клітини і висівають їх на чашки,