Дослідження властивостей генноінженерних білків – потенційних компонентів вакцин

Щоб напрацювати трансформовані клітини і отримати білок Core, проводили культивування в об’ємі середовища 200 мл.

Приготування буферів для афінної очистки білка на колонці з Ni-NTA-агарозою

Буфер для лізису (V=30 мл, pH=8, 0) :

50 mM NaPh – 3 мл;

500 mM NaCl – 3 мл;

10 mM імідазол – 0, 3 мл;

5 mM β-меркатоптоетанол – 11, 7 мл.

Буфер для елюції (V=10 мл, pH=8, 0) :

50 mM NaPh – 1 мл;

150 mM NaCl – 0, 3 мл;

200 mM імідазол – 2 мл;

5 mM β-меркатоптоетанол – 6, 9 мл.

Буфер для промивки (V=20 мл, pH=8, 0) :

50 mM NaPh – 2 мл;

500 mM NaCl – 2 мл;

20 mM імідазол – 0, 4 мл;

5 mM β-меркатоптоетанол – 7, 8 мл.

Буфер для змиву (V=20 мл, pH=8, 0) :

50 mM NaPh – 2 мл;

1 mM NaCl – 4 мл;

300 mM імідазол – 6 мл;

Отримання клітинного лізату та екстракту клітин E. coli

Суспензію клітин, отриману після культивування, цинтрифугували і збирали осад бактеріальних клітин та ресуспензували його у 12 мл лізис-буфера.

Обережно розтирали осад скляною паличкою, потроху додаючи лізис-буфер та здійснювали руйнування клітин на ультразвуковому дезінтеграторі Sonicator-4000 (Misonix Qsonica LLC) : 6 циклів по 20 с озвучання та 20 с перерва між циклами. Отриманий лізат переносили у пробірки «Епендорф», залишки клітин осаджували на мікроцентрифузі Sigma 1-13 (Sigma, США) при 13000 об/хв протягом 30 хв у попередньо охолодженому роторі [6].

Супернатант обережно збирали, осад заморожували при -20 °С.

 

 

Очищення рекомбінантного білка core здійснювали методом афінної метал-хелатуючої хроматографії на колонці з Ni-NTA-агарозою.

Готували колонку, відновивши її 10 мл лізис-буферу. Наносили супернатант на колонку (12 мл), збирали проскок та промивали колонку протягом 2 хв 10 мл буферу для промивання, збирали фракцію промивання (50 мкл) [18].

У 5 пробірок «Епендорф» елювали по 0, 5 мл буферу для елюції, після чого наносили на колонку 1 мл буферу для змивання. Збирали змив (50 мкл). Всі фракції і аліквоти зберігали про 4 °С.

Промивали колонку 5 мл буферу для змиву та консервували її 10 мл дистильованої води та 10 мл 25% C2H5OH [17, 18].

 

 

Для проведення імуноферментного аналізу з метою виявлення антитіл проти Кор-білка застосовували рекомбінантний Кор-білок. Спочатку виконували розведення досліджуваних та контрольних зразків і кон'югату, використовуючи фосфатно-сольовий розчин – Твін 80 (ФСР-Т), що містив 0, 9% NaCl; 0, 1% Na2HPO4; 0, 1% Твін-80. Припустимий інтервал рН – 7, 2-7, 6. У якості коньюгата використовували готові імунні сироватки в концентрациії 1 мкг / мл. Як субстрат для прояву пероксидазної реакції використовували розчин тетраметилбензидину (ТМБ) у цитратному буфері, рН 5, 0 (Na2HPO4 × 12H2O – 0, 2 моль/л, 14, 3 г солі / 200 мл H2O). Для зупинки ферментативної реакції використовували 5% -ий розчин сірчаної кислоти (стоп-реагент) [20].

Облік результатів здійснювали автоматично з використанням автоматичного імуноферментного аналізатора Mago 4 (USA).

Статистичну обробку даних проводили з використанням програми Microsoft Exell.

 

 

 

Для створення штамів продуцентів Кор-білка було отримано культури компетентних клітин E. coli штамів codon+, pRARE2, pRPTGRO, pRPTKJG, після чого була проведена трансформація цих штамів методом heat-shock комерційною плазмідою pET15b core, яка містила ген, відповідний за синтез Кор-білка (рис. 5. 1).

Рис. 5. 1 Рестрикційна карта плазміди pET15b

Далі, було проведено пошук трансформованих штамів та напрацювання рекомбінантного білка, шляхом додавання індуктору для експресії білка core ВГС – ізопропіл-β-D-1-тіогалактопіранозиду (ІПТГ).

Оцінку результативності трансформації здійснювали з використанням електрофорезу осаду клітин досліджуваних штамів. Результати електрофорезу представлені на рис. 5. 2.

Рис. 5. 2 Електрофореграма білків клітин E. coli у поліакриламідному гелі (через 3 год від внесення індуктора)

З електрофореграми видно, що через 3 год від початку індукції було напрацьовано рекомбінантний протеїн core. Також, дослід показав, що трансформація була успішною, а отже, придатними в якості продуцентів виявилися штами Codon+ та pGRO. Лише вони показали значну експресію протеїну core ВГС. Штами E. coli pKTG і pRARE2 не експресували питомого білка, а отже, не були трансформовані.

У подібний спосіб було трансформовано клітини для отримання рекомбінантного аналога білка р24 вірусу BLV [48, 51]. У цьому випадку було використано такі штами-реципієнти з музейної колекції штамів НВК «Діапроф-Мед»: Escherichia coli BL21 (DE3) [E. coli B F-ompT HsdSB (rB-mB-) gal dcm λ (DE3) ], E. coli BL21 (DE3)