Дослідження властивостей генноінженерних білків – потенційних компонентів вакцин

Після отримання свіжого препарату компетентних / електрокомпетентних клітин необхідно провести їх контрольну трансформацію відомою кількістю плазміди для того, щоб перевірити чистоту отриманого препарату компетентних клітин таприблизно оцінити їх компетентність. Компетентність клітин можна визначити, як кількість колоній, яка виростає на чашці після трансформації клітин 1 мкг ДНК [17].

Щоб оцінити компетентність отриманого препарату, необхідно порахувати кількість колоній, що виросли на чашці після трансформації (якщо виросло багато колоній, чашку зручно ділити на сектори, рахувати число колоній в кожному секторі, а потім множити отримане значення на число секторів), і знаючи кількість ДНК, яка була взята на трансформацію, розрахувати компетентність клітин на 1мкг ДНК. Компетентність клітин 107 – 108 може бути оцінена, як висока [17, 8].

 

 

 

 

Дослідження виконували на базі лабораторії відділу Білкової інженерії Інституту молекулярної біології і генетики НАН України.

Об’єктом дослідження була здатність модифікованих штамів E. coli codon+, pRARE2, pRPTGRO, pRPTKJG до продукції кор-білка, що є антигеном, придатним для створення вакцини проти гепатиту С.

Для досліджень використовували штами E. coli codon+, pRARE2, pRPTGRO, pRPTKJG з колекції культур мікроорганізмів Інституту молекулярної біологїі і генетики НАН України (м. Київ). Було модифіковано 4 штами, яким вводили штучну камерційну плазміду pET15b core, отриману з інституту вірусології РАМН. Рекомбінантні штами відбирали на середовищах: рідке поживне середовище LB, тверде нативне середовище LB, тверде середовище LB для контролю та середовище 2YT. З них виділяли білок Core вірусу ВГС – це невеликий білок, що складається з 191 амінокислот (~ 21 кДа), це самий консервативний білок всередині вірусного генома. Структурний білок Core розташований на N-кінці поліпептиду. Протеїн Core має здатність звьязувати різні РНК: рибосомну РНК [4], транспортну РНК [10] та вірусну РНК ВГС [11]. Місце взаємодії знаходиться в N-кінцевій області протеїну Core (домену D1) [12]. Взаємодія Core зі своєю власною РНК призначена не тільки для утворення вірусного капсида. Протеїн Core має здатність регулювати свою власну трансляцію завдяки взаємодії з регіоном 5'UTR (IRES) вірусного генома. Протеїн Core ВГС є цільовим об'єктом для протеїнкінази, його фосфорилювання необхідно для придушення експресії і реплікації вірусу гепатиту В в клітинах, особливо фосфорилювання серина Core 116 відіграє роль репрессора в транскрипції його гена а також локалізації Core в ядрі [13]. Протеїн Core має важливе значення для взаємодії з вірусною РНК. Проте, цей білок має можливість взаємодіяти з іншими вірусними білками ВГС.

Досліджували його властивість специфічно взаємодіяти з імунними сироватками, що містять антитіла до ВГС та подальше використання для створення імуноферментних тест-систем, призначених для діагностики і моніторингу вірусного гепатиту С.

 

 

Для культивування робочих культур мікроорганізмів використовували наступні середовища: рідке поживне середовище LB, тверде нативне середовище LB, тверде середовище LB для контролю та середовище 2YT [6].

Для приготування рідкого поживного середовища LB використовували колбу об’ємом 0, 5 л. Зважували на аналітичних електронних вагах KERN ABS/ABj (Kern, Німеччина) наважки:

Бактотриптон (Merck, Німеччина) – 5 г. ;

Дріжджовий екстракт (ІПО, РФ) – 2, 5 г. ;

NaCl (НВП «Альфарус», Україна) – 5 г.

Доводили до об’єму 0, 5 л дистильованою водою, автоклавували при 0, 5атм., кип’ятили.

Для приготування твердого середовища LB для контролю та твердого нативного середовища відбирали по 80 мл проавтоклавованого рідкого середовища LB і додавали 1, 2 г агару (Difсo, США), зваженого на аналітичних вагах KERN ABS/ABj для кожного середовища, та кип’ятили.

Готували по 80 мл агаризованого середовища LB, до якого додавали 60 мкг/мл хлорамфеніколу, 100 мкг/мл ампіциліну для контрольного середовища та 80 мкг/мл для нативного середовища та розливали на 8 чашок Петрі (d=10 см).

Для приготування середовища 2 YT використовували колбу об’ємом 100 мл. На аналітичних вагах зважували 1, 6 г бактотриптона, 1 г дріжджового екстракту та 0, 5 г NaCl. Використовували 97 мл дистильованої води [6, 24].

 

 

Для отримання компетентної культури використовували нічну культуру клітин E. coli штамів codon+, pRARE2, pRPTGRO, pRPTKJG. Для цього у 4 стерильні колби ємністю 20 мл кожна, вносили по 10 мл приготованого рідкого середовища LB. Потім до колб з середовищем вносили по 10 мкл канаміцину та по 1 колонії E. coli кожного штаму, вирощених на твердому нативному середовищі LB. Далі, інкубували в шейкері New Brunswick Scientific Excella E24 Incubator (New Brunswick Scientific, Germany) на швидкості RPM = 200 при температурі 37°С протягом ночі.

Для отримання компетентних клітин E. сoli штамів codon+, pRARE2, pRPTGRO, pRPTKJG для модифікування плазмідою pET15b core до 4 колб, об’ємом 100 мл стирильно вносили по 15 мл поживного середовища LB з 30 мкг/мл хлорамфеніколу.

Додавали по