Дослідження властивостей генноінженерних білків – потенційних компонентів вакцин

Одержання компетентних клітин та їх трансформацію здійснювали, як і у нашому випадку за стандартною схемою з використанням 0, 1М CaCl2. Для трансформації застосовувалася рекомбінантна плазміда, створена на основі експресійного вектора рЕТ24а шляхом клонування фрагмента гена gag, який кодує білок р24 BLV. Експресія рекомбінатного білка контролювалась промотором бактеріофага Т7. Як генетичний маркер плазміда міститила ген стійкості до канаміцину [48].

Для контролю біосинтезу цільового білку здійснювали електрофорез (рис. 5. 3).

Рис. 5. 3 Електрофореграма розподілу рекомбінантного білка р24 за фракціями для різних штамів-реципієнтів E. сoli (БМ – лізат біомаси; ЕТВ – екстракт тілець включення; Розч – розчинна фракція; BL – E. coli BL21 (DE3) ; RIL – E. coli BL21 (DE3) CodonPlus_RIL; RP – E. coli BL21 (DE3) CodonPlus_RP; AI – E. coli BL21 (DE3) AI)

З електрофореграми можна побачити, що в усіх досліджуваних лізатах мав місце індукований біосинтез поліпептиду очікуваної молекулярної маси (~ 25кДа) [48].

У випадку з отриманням рекомбінантного ядерного антигену вірсу гепатита В, що містить позаклітинний домен білка М2 вірусу грипу у районі верхньої імунодомінантної петлі, в якості основи для створення рекомбінантних векторів експресії використовували вектор pQE60 (Qiagen). Для отримання штамів E. coli – продуцентів рекомбінантних білків відповідні вектори вводили у клітини E. coli штаму DLT1270 за допомогою трансформації. За аналогією, для індукції синтезу рекомбінантних білків в культуру було внесено ІПТГ [47, 52].

Рівень синтезу цільових білків оцінювали за допомогою денатуруючого електрофорезу у поліакриламідному гелі (рис. 5. 4).

Рис. 5. 4 Експресія рекомбінантних білків HBc / M2ek і HBc / 2M2ek у штамах-продуцентах

1 – маркер молекулярної ваги; 2 – білковий препарат з неіндукованої культури;

3 – білковий препарат з культури DLT1270 pQE60 HBc / M2ek після індукції;

4 – білковий препарат з культури DLT1270 pQE60 HBc / 2M2ek після індукції.

З представленої електрофореграми можна побачити, що всі 3 дослідні препарати містили певні шукані фракції, про що свідчать лінії співпадіння продуктів електрофорезу [47].

 

 

Завдяки використанню плазміди pET15b Core, амінокислотна послідовність рекомбінантного Кор-білка містила додаткові 6 гістидинових основ, необхідних для хроматографії на Ni-агарозному сорбенті, що дозволило виділити високоочищенний білок. Результати очищення Кор-білка за допомогою афінної хроматографії представлені на рис. 5. 5.

Рис. 5. 5 Афінна хроматографія Кор-білка

При очищенні за допомогою хроматографії, спостерігали вихід різних протеїнів та чітке розрізнення між двома зонами в графіку елюції білка. Перша зона (1) відповідає результату, при якому протеїни вийшли з колони не вступаючи в реакцію з Ni2+, оскільки в їх послідовності не було гістидина. Після проходження даних протеїнів через колонку, спостерігали зниження абсорбції до моменту, коли буфер B починав проходити через колонку. У цьому випадку спостерігали пік абсорбції в зоні (2), яка відповідає результату, при якому виходить потрібний протеїн, тобто Кор-білок.

Елюція білка здійснювалася за допомогою буфера B, що містить високу концентрацію імідазолу. Молекула імідазолу має дуже високу афінність зв'язування з Ni2+, а отже, вступає в конкуренцію з залишками гістидину і призводить до їх вимивання.

Цей пік відповідав найбільш високій абсорбції у зоні (2). Зібрані фракції для аналізу – 1, 2, 3, 4, 5, що відповідають другій зоні (2), були проаналізовані за допомогою електрофорезу (рис. 5. 6).

Рис. 5. 6 Електрофореграма очищеного Кор-білку

Електрофорез дозволив виявити фракції, в яких Кор-білок був очищений. На даній електрофореграмі – це лунка 3.

Схожим чином було здійснено очищення рекомбінантного білка р72, який використовувся для вивчення африканської чуми свиней [35]. Рекомбінантний білок Р72 експресується у pET-системі у формі спліт-білка з гістидиновими залишками на кінці. Тому для його очищення використовували метод металохелатної афінної хроматографії на колонці з нікелевим сорбентом HIS-Select Nickel Affinity Gel [20].

Однак, для очищення білка p30, який також використовувся у даному дослідженні, використовували колонки фірми LKB Produkter з целюлозним сорбентом – мікрокристалічною целюлозою марки Avicel (MERCK), оскільки у плазміді pTT9 / ASFVp30, якою трансформували клітини, є ген CBD, кодуючий у структурі рекомбінантного білка целлюлозо-зв'язуючий домен, який забезпечує сорбцію рекомбінантного білка на целюлозі [20].

 

 

Імуноферментний аналіз здійснювали для перевірки наявності у отриманих фракціях питомого білка на автоматичному імуноферментному аналізаторі Mago 4. Для проведення ІФА використовували, крім фракції 3, і всі інші фракції.

Очищений рекомбінантний Кор-білок у ІФА специфічно взаємодіяв з імунними сироватками, що містять Anti-HCV-core (антитіла класу IgG до антигену core).

Результати проведення ІФА представлені у табл. 5. 1. Жирним шрифтом відзначена позитивна реакція (присутність Кор-білка в зразках).

У таблиці показані розведення сироватки, фракції білків та результати їх взаємодії, які виражені у числових значеннях оптичної густини. Отже, за результатами