Методи фарбування кісткового мозку та діагностика на гістопрепаратах лейкози

Для поступового і кращого просочування парафіном проби з хлороформу переносили в розтоплену суміш хлороформу з парафіном і залишали в ній при температурі 40° (в термостаті) на 2 год. Далі проби перекладали в розплавлений парафін і поміщали у термостат (54°). Просочування проб парафіном проходило у двох порціях (чашечках), позначених як перша і друга. Проби спочатку поміщали в першу чашку на 1 год, потім перекладали теплим пінцетом у другу і витримували ще 1 год.

Після того, як проби пробули у другому парафіні достатньо часу їх заливали парафіном у чашках Петрі. Дно чашки Петрі змазували гліцерином і підігрівали на спиртівці до температури 60 °С. Проби з другого парафіну гарячим анатомічним пінцетом швидко перекладали в чашку Петрі і заливали чистим парафіном, який спеціально тримали для цього в термостаті в розплавленому стані.

Із застиглого парафіну вирізали скальпелем блоки з тканинами, залишаючи навколо кожної з них смужку парафіну шириною близько 2 мм.

Наклеювання парафінових блоків на колодки. Парафінові блоки наклеювали на дерев’яні колодки стороною з більшою кількістю парафіну.

Різання парафінових блоків, приготування предметних скелець і наклеювання зрізу.

Парафіновий блок (на колодці) міцно закріплювали на об’єктотримачі мікротома. Добре зафіксований в об’єктотримачі блок обрізали, викидаючи вільний чистий парафін (розміщений на верхній частині колодки поза тканиною).

Товщина парафінових зрізів досягала 10 мкм.

Одержані зрізи акуратно за допомогою кісточки і препарувальної голки знімали з леза, не торкаючись його, і переносили у велику посудину з теплою дистильованою водою так, щоб сторона зрізу, що була обернена до ножа, потрапила на поверхню води.

Для наклеювання розпрямлений зріз виловлювали з води на вже підготовлене предметне скло; спочатку його занурювали одним кінцем у чашку з водою, підводили під зріз і підхоплювали, утримуючи препарувальною голкою на середині скла. Залишки води навколо зрізу старанно витирали ганчіркою і пригладжували пальцем через 2-3 шари сухого і гладкого фільтрувального паперу. Зрізи для подальшої роботи добре висушували в термостаті при температурі 40 °С протягом двох год.

 

 

Фарбування парафінових зрізів. Наклеєні на предметні скла парафінові зрізи перед фарбуванням звільняли від парафіну за допомогою розчинника. Для цього використовували ксилол, який лили безпосередньо на зріз і витримували в ньому 2 хв. Таким чином обробляли 3 рази. Для прискорення розчинення рухали предметним склом.

Після розчинення парафіну ксилол змивали 96° спиртом, використовуючи його повторно, вибирали ганчіркою залишки спирту навколо зрізу і швидко переносили у воду. Там предметні скельця зі зрізами залишали на 2 хв, тобто доти, поки вони добре не відмиються. Якщо після видалення парафіну і ксилолу у воді навколо зрізу утворювалось помутніння, його ще раз обробляли спиртом, щоб емульсія, яка утворилася, не перешкоджала фарбуванню.

Із води препарати надходили на фарбування (Меркулов Г. А., 1969).

 

 

Зрізи фарбують у свіжопрофільтрованому гематоксиліні протягом 5 хв.

Промивали у водопровідній воді 3 хв.

3. Переносили в чашку з солянокислим спиртом (0, 5-1% HCl на 70° спирті) і диференціювали в ньому протягом 30 секунд. Зріз під час диференціювання червонів.

Перекладали у велику чашку з водопровідною водою.

Водопровідна вода, яку використовували для промивання, має слаболужну реакцію. В теплій водопровідній воді зрізи синіють швидше. Тому посиніння зрізу досягали, залишаючи їх у теплій воді на 15 хв.

Підсинені і добре промиті зрізи далі обробляли у звичному порядку, тобто виймали з чистої води, дофарбовували еозином, споліскували у воді, зневоднювали 96° спиртом і т. д.

При такому фарбуванні з диференціюванням препарати одержали більш контрастними і яскравими, сині і темні ядра різко виділялись на зовсім чистому рожевому фоні.

Велика хвилястість препарату значно ускладнює мікроскопування і спричиняє постійну роботу мікрогвинта, тому потрібно притискати покривне скло препарувальною голкою, витискуючи залишки бальзаму. Зрізи залишали під пресом на 24 год.

Використовували бальзам, який має консистенцію гліцерину.

 

 

Зафарбовування за методом Романовського-Гімза – це цитологічний метод зафарбовування мікроорганізмів, клітинних структур и тканин різних видів (в тому числі крові) для вивчення методом світлової мікроскопії. Назва барвника – «GiemsascheLözungfürdieRomanowskyfärbung» (розчин Гімзи для зафарбовування по Романовському). Зафарбовує ацидофільні утвори в різні відтінки червоного кольору, базофільні – в кольори від пурпурного до синього.

Мазки (гістозрізи) фіксовані в метиловому спирті, фарбували розчином (1 мл готової рідкої фарби + 2 мл основного буферного розчину + 47 мл дистильованої води) на протязі 40-120 хв (тривалість зафарбовування підбирають емпірично). Використовують фосфатний буфер, рН якого 5, 8-6, 0.

Промивають в дистильованій воді, висушують і досліджують при іммерсії (GiemsaG., 1904).

Результат зафарбовування: бактеріїзафарбовуються в фіолетово-червонийколір, цитоплазма клітин – в голубий, ядра – в червоний. При зафарбовуваннінайпростішихїхня цитоплазма набуває голубогокольору, а ядра -червоно-фіолетового (рис. 1).

 

Рис. 1. АмастіготиLeishmania tropica, розташовані в макрофагах. Збільшення 10×100, фарбування заРомановського-Гимза.